一种治疗淋巴瘤的中药组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及中药组合物技术领域，具体地说，涉及一种治疗淋巴瘤的中药组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，主要表现为无痛性淋巴结肿大，肝脾肿大，全身各组织器官均可受累，伴发热、盗汗、消瘦、瘙痒等全身症状。
3.根据瘤细胞分为非霍奇金淋巴瘤(nhl)和霍奇金淋巴瘤(hl)两类。病理学特征在霍奇金淋巴瘤为瘤组织内含有淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞和特异性的里-斯(reed-steinberg)细胞，hl按照病理类型分为结节性富含淋巴细胞型和经典型，后者包括淋巴细胞为主型、结节硬化型、混合细胞型和淋巴细胞消减型。nhl发病率远高于hl,是具有很强异质性的一组独立疾病的总和，病理上主要是分化程度不同的淋巴细胞、组织细胞或网状细胞，根据nhl的自然病程，可以归为三大临床类型，即高度侵袭性、侵袭性和惰性淋巴瘤。根据不同的淋巴细胞起源，可以分为b细胞、t细胞和nk细胞淋巴瘤。
4.由于淋巴瘤是免疫细胞的恶性克隆，直接导致机体免疫功能的下降，属于因“毒”致“虚”，“毒”为其病机核心。邪气不散，必耗伤正气，故为“毒”。淋巴瘤的“毒邪”常由痰、瘀、热积聚变化而来。金
·
张子和在《儒门事亲
·
汗下吐三法该尽治病诠》有云：“夫病之一物，非人身素有也。或自外而入，或由内而生，皆邪气也。邪气加诸身
……
，先论攻其邪，邪去而元气自复也”，“良工之治病者，先治其实，后治其虚”。中医应用清热解毒、化痰祛瘀或以毒攻毒诸法治疗“毒邪”已有上千年历史。
5.中国专利文献cn109200248a公开了一种治疗淋巴瘤的中药组合物，按重量份数计中药原料药为：三棱20-30份、莪术15-30份、黄芪20-60份、玄参25-50份、苦参10-20份、夏枯草20-50份、当归15-30份、丹参30-60份、川芎20-30份、白花蛇舌草20-60份、甘草10-30份、半枝莲20-35份、半夏10-30份、黄芩15-30份、连翘15-30份、红花15-30份、党参35-60份、白术20-30份、柴胡20-30份、板蓝根15-30份、浙贝母10-30份、猫爪草15-30份、茯苓10-35份、露蜂房20-30份、女贞子15-60份、白芍20-30份。中国专利文献cn106075223a公开了一种治疗淋巴瘤的中药组合物，其中药原料及重量份配比为：熟地黄10-30份，山慈菇10-20份，牡蛎10-20份，牡丹皮5-15份，夏枯草10-20份，紫花地丁10-20份，木馒头10-20份，土贝母5-15份，白花蛇舌草10-20份，菟丝子10-20份，龙胆草5-15份，车前子10-20份，昆布10-20份，忍冬藤10-20份，川芎5-15份，党参10-20份，板蓝根10-20份，木通5-15份，黄药子10-20份，墨旱莲10-20份，三棱5-15份，玄参10-20份，黄精10-20份，甘草5-15份。但是关于本发明一种治疗淋巴瘤的中药组合物及其制备方法和应用目前还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗淋巴瘤的中药组合物。
7.本发明的再一的目的是，提供所述中药组合物的制备方法。
8.本发明的另一的目的是，提供所述中药组合物的应用。
9.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
10.一种治疗淋巴瘤的中药组合物，所述中药组合物由以下重量份配比的药物组成：夏枯草10-30份、山慈菇3-18份、石见穿9-30份、紫花地丁9-30份、急性子3-18份、生薏苡仁25-35份、三棱9-30份、莪术9-30份、地骨皮10-30份、败酱草3-18份、鳖甲3-18份、知母3-18份、陈皮3-18份、姜半夏3-18份、白茯苓5-30份、甘草3-9份。
11.优选地，所述中药组合物由以下重量份配比的药物组成：夏枯草15-25份、山慈菇5-15份、石见穿13-18份、紫花地丁13-18份、急性子5-15份、生薏苡仁28-33份、三棱13-18份、莪术13-18份、地骨皮15-25份、败酱草5-15份、鳖甲5-15份、知母5-15份、陈皮5-15份、姜半夏5-15份、白茯苓10-15份、甘草4-8份。
12.更优选地，所述中药组合物由以下重量份配比的药物组成：夏枯草18份、山慈菇9份、石见穿15份、紫花地丁15份、急性子9份、生薏苡仁30份、三棱15份、莪术15份、地骨皮18份、败酱草9份、鳖甲9份、知母9份、陈皮9份、姜半夏9份、白茯苓12份、甘草6份。
13.优选地，所述的中药组合物还包括以下重量份的原料药：雄黄0.05-0.1份。
14.更优选地，所述的中药组合物还包括以下重量份的原料药：雄黄0.07-0.1份。
15.更优选地，所述的中药组合物还包括以下重量份的原料药：雄黄0.1份。
16.为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
17.如上任一所述的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：按重量份配比称取原料药，粉碎、混匀，得到药物混合物，加入相当于药物混合物总重量3-5倍的水，文火煎煮30-60分钟，过滤，收集滤液即得。
18.为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
19.如上任一所述的中药组合物在制备治疗淋巴瘤药物中的应用。
20.优选地，所述的药物剂型为口服制剂。
21.更优选地，所述的口服制剂剂型为水煎剂、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、冲剂、口服液或胶囊。
22.优选地，所述的淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
23.更优选地，所述的非霍奇金淋巴瘤为b细胞非霍奇金淋巴瘤。
24.本发明优点在于：
25.1、本发明中药组合物(解毒消瘤方)符合“君臣佐使”配伍原则，依据张子和之祛邪安正理论，采用以清热解毒攻邪为主的中药复方治疗淋巴瘤。方中夏枯草、山慈菇、石见穿均可清热、解毒、散结、消肿，共为君药；紫花地丁、急性子、鳖甲、生薏苡仁、三棱、莪术共为臣药，辅助君药以加强清热解毒、破瘀利湿、软坚散结之力；佐以陈皮、半夏、白茯苓、知母、地骨皮、败酱草以化痰、滋阴、凉血、解毒；以甘草为使，调和诸药；诸药合用，共奏清热解毒、健脾化痰、散结消癥之功。
26.2、本发明中药组合物(解毒消瘤方)能在有丝分裂的过程中阻滞在g2/m期，有效抑制淋巴瘤细胞raji细胞和jeko-1细胞的增殖生长，且呈时间和浓度依赖性。解毒消瘤方还能够上调淋巴瘤细胞促凋亡蛋白bax和caspase3的基因的表达，同时抑制淋巴瘤细胞抗凋亡蛋白bcl2的基因的表达，改变raji细胞和jeko-1细胞的细胞形态，形成明显的凋亡小体，有效促进淋巴瘤细胞的凋亡，且呈浓度依赖性。
27.3、本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤移植瘤裸鼠具有明显的抑瘤作用，上调淋巴瘤细胞促凋亡蛋白bax和caspase3的基因的表达，同时抑制淋巴瘤细胞抗凋亡蛋白bcl2的基因的表达。
附图说明
28.图1.本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞的生长的影响。a：cck-8的计数结果。b：软琼脂集落形成结果。
29.图2.透射电镜下本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞形态的影响。a：raji细胞对照组；b：raji细胞加药组；c：jeko-1细胞对照组；d：jeko-1细胞加药组。(透射电镜比例尺5um(
×
2000))
30.图3.不同浓度的本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞raji细胞和jeko-1细胞的细胞周期的影响。(*p＜0.05)
31.图4.不同浓度的本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞raji细胞和jeko-1细胞的细胞周期的影响。(*p＜0.05)
32.图5.不同浓度(0、1、4、8mg/ml)本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞凋亡的影响。a：解毒消瘤方对淋巴瘤raji细胞凋亡的影响。b：解毒消瘤方对淋巴瘤jeko-1细胞的影响。(***p＜0.001，**p＜0.01)
33.图6.a和b为不同浓度(0、1、4、8mg/ml)本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞raji和jeko-1细胞凋亡相关caspase3、bax、bcl2基因的影响。(**p＜0.01，*p＜0.05)
34.图7.本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞相关凋亡蛋白的表达及其分析。(**p＜0.01，*p＜0.05)
35.图8.本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞移植瘤的抑制作用。a：淋巴瘤细胞皮下移植瘤瘤体剥离拍照。b：淋巴瘤细胞皮下移植瘤瘤体重量比较散点图。c：淋巴瘤细胞皮下移植瘤瘤体体积变化。d：淋巴瘤细胞皮下移植瘤裸鼠体重变化。
36.图9.淋巴瘤细胞移植瘤瘤体组织he染色(400
×
)。
37.图10.淋巴瘤细胞移植瘤瘤体凋亡蛋白的表达(400
×
)。
38.图11.各组瘤体免疫组化阳性强度分析。
具体实施方式
39.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
40.实施例1本发明中药组合物的制备(一)
41.按重量份配比称取夏枯草10份、山慈菇3份、石见穿9份、紫花地丁9份、急性子3份、生薏苡仁25份、三棱9份、莪术9份、地骨皮10份、败酱草3份、鳖甲3份、知母3份、陈皮3份、姜半夏3份、白茯苓5份、甘草3份、雄黄0.05份。
42.实施例2本发明中药组合物的制备(二)
43.按重量份配比称取夏枯草10份、山慈菇3份、石见穿9份、紫花地丁9份、急性子3份、生薏苡仁25份、三棱9份、莪术9份、地骨皮10份、败酱草3份、鳖甲3份、知母3份、陈皮3份、姜半夏3份、白茯苓5份、甘草3份。
44.实施例3本发明中药组合物的制备(三)
45.按重量份配比称取夏枯草30份、山慈菇18份、石见穿30份、紫花地丁30份、急性子18份、生薏苡仁35份、三棱30份、莪术30份、地骨皮30份、败酱草18份、鳖甲18份、知母18份、陈皮18份、姜半夏18份、白茯苓30份、甘草9份、雄黄0.1份。
46.实施例4本发明中药组合物的制备(四)
47.按重量份配比称取夏枯草30份、山慈菇18份、石见穿30份、紫花地丁30份、急性子18份、生薏苡仁35份、三棱30份、莪术30份、地骨皮30份、败酱草18份、鳖甲18份、知母18份、陈皮18份、姜半夏18份、白茯苓30份、甘草9份。
48.实施例5本发明中药组合物的制备(五)
49.按重量份配比称取夏枯草15份、山慈菇5份、石见穿13份、紫花地丁13份、急性子5份、生薏苡仁28份、三棱13份、莪术13份、地骨皮15份、败酱草5份、鳖甲5份、知母5份、陈皮5份、姜半夏5份、白茯苓10份、甘草4份、雄黄0.07份。
50.实施例6本发明中药组合物的制备(六)
51.按重量份配比称取夏枯草15份、山慈菇5份、石见穿13份、紫花地丁13份、急性子5份、生薏苡仁28份、三棱13份、莪术13份、地骨皮15份、败酱草5份、鳖甲5份、知母5份、陈皮5份、姜半夏5份、白茯苓10份、甘草4份。
52.实施例7本发明中药组合物的制备(七)
53.按重量份配比称取夏枯草25份、山慈菇15份、石见穿18份、紫花地丁18份、急性子15份、生薏苡仁33份、三棱18份、莪术18份、地骨皮25份、败酱草15份、鳖甲15份、知母15份、陈皮15份、姜半夏15份、白茯苓15份、甘草8份、雄黄0.1份。
54.实施例8本发明中药组合物的制备(八)
55.按重量份配比称取夏枯草25份、山慈菇15份、石见穿18份、紫花地丁18份、急性子15份、生薏苡仁33份、三棱18份、莪术18份、地骨皮25份、败酱草15份、鳖甲15份、知母15份、陈皮15份、姜半夏15份、白茯苓15份、甘草8份。
56.实施例9本发明中药组合物的制备(九)
57.按重量份配比称取夏枯草18份、山慈菇9份、石见穿15份、紫花地丁15份、急性子9份、生薏苡仁30份、三棱15份、莪术15份、地骨皮18份、败酱草9份、鳖甲9份、知母9份、陈皮9份、姜半夏9份、白茯苓12份、甘草6份、雄黄0.1份。
58.实施例10本发明中药组合物的制备(十)
59.按重量份配比称取夏枯草18份、山慈菇9份、石见穿15份、紫花地丁15份、急性子9份、生薏苡仁30份、三棱15份、莪术15份、地骨皮18份、败酱草9份、鳖甲9份、知母9份、陈皮9份、姜半夏9份、白茯苓12份、甘草6份。
60.实施例11本发明中药组合物水煎剂的制备(十一)
61.按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，混匀，加入3-5倍的水，文火煎煮30-60分钟，水煎两次，(两层医用纱布)过滤，每次取汁200ml，收集滤液即得水煎剂。
62.实施例12本发明中药组合物颗粒剂的制备(十二)
63.按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1的清膏。清膏加入乙醇，静置24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2的稠膏。稠膏进行喷雾干燥，得干膏细粉。将干膏细粉加入糊精，混合均匀，按常规方法制粒，干燥，制成颗粒剂。
64.实施例13本发明中药组合物片剂的制备(十三)
65.按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1的清膏。清膏进行喷雾干燥，得到干膏细粉。将干膏细粉与羧甲基淀粉钠、微晶纤维素混合均匀，按常规方法制粒，干燥，加入硬脂酸镁、二氧化硅，混匀，按常规方法压片，制成分散片。
66.实施例14本发明中药组合物胶囊剂的制备(十四)
67.按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.15的清膏。清膏进行喷雾干燥，得到干膏细粉。加入硬脂酸镁、滑石粉，混匀，按常规方法加入空心胶囊，制成胶囊剂。
68.实施例15本发明中药组合物滴丸剂的制备(十五)
69.按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.18的清膏。清膏进行喷雾干燥，得到细粉。加入适量水或/和黄酒，制成水丸剂。或加入适量乙醇和大豆油制成软材，软材用微丸制丸机制丸，干燥，过筛，制成微丸。或以聚乙二醇为基质、二甲基硅油为冷凝液，滴制成丸，制成滴丸剂。
70.实施例16本发明中药组合物口服液的制备(十六)
71.按照实施例1-10任一所述的重量份配比称取各原料药，加水煎煮3次，合并滤液，浓缩至相对密度为1.1的清膏。清膏加入乙醇，静置24小时，滤过，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.2的稠膏。按常规方法取甜菊糖溶解于纯水中，加入苯甲酸钠、纯化水，与稠膏混合均匀，制成口服液。
72.实施例17本发明中药组合物对淋巴瘤细胞株raji/jeko-1的体外实验
73.1材料
74.1.1细胞株
75.在中科院上海生命科学研究院购得人burkitt淋巴瘤raji细胞株、套细胞jeko-1淋巴瘤细胞株。
76.1.2实验用药
77.本发明中药组合物(解毒消瘤方)：中药颗粒剂，其组成为夏枯草18g、紫花地丁15g、山慈菇9g、急性子9g、石见穿15g、三棱15g、薏苡仁30g、莪术15g、地骨皮18g、败酱草9g、知母9g、陈皮9g、姜半夏9g、白茯苓12g、鳖甲9g、甘草6g。江阴天江药业有限公司处购得颗粒剂，且必须是同一批次药物，将药物按照生药比混合，加入一定体积的rpmi1640培养液混合，3000g离心15分钟，去除沉淀，再将收集到的药液3000g离心5分钟，去除药渣，最后将药液先滤过0.45μm的滤器再滤过0.22μm的滤器除菌处理，中药原液ph值在正常范围内，将其保存于4℃冰箱，使用前释稀到至目标浓度。
78.1.3实验材料
79.表1实验试剂
[0080][0081]
表2仪器设备
[0082][0083]
2实验方法
[0084]
2.1细胞培养
[0085]
2.1.1细胞复苏
[0086]
(1)将水浴箱开关打开，调至37℃，将需要的耗材(50ml离心管、15ml离心管、培养瓶等)放入超净台紫外照射30分钟。
[0087]
(2)从-80℃冰箱中取出raji细胞和jeko-1细胞，立即置于37℃恒温水浴箱中，轻轻摇动，使其尽快在1分钟内融化。
[0088]
(3)用酒精喷壶喷洒并用纸巾擦拭冻存管外壁，在超净台内吸入预先准备的含有培养基的离心管，1000r离心，5分钟，去掉上清，沉淀即为raji细胞和jeko-1细胞。
[0089]
(4)加入1ml完全培养基轻轻吹打，重悬细胞，将细胞悬液转移到培养瓶中，并加入7ml完全培养基。
[0090]
(5)将装有raji细胞和jeko-1细胞的培养瓶放入5％co2培养箱，37℃孵育。
[0091]
2.1.2细胞传代
[0092]
(1)酒精擦拭整理超净台，将实验所需耗材放入超净台紫外照射30分钟。
[0093]
(2)将装有raji细胞和jeko-1细胞的培养瓶从培养箱中取出先在显微镜下观察细胞状态，两种细胞都属于悬浮细胞，抱团生长，后放入超净台，用3ml滴管吸入15ml离心管，1000r离心5分钟，去掉上清，沉淀即为raji细胞和jeko-1细胞。
[0094]
(3)每个离心管加入2-3ml pbs混悬洗涤，1000r离心5分钟。
[0095]
(4)弃上清液，加入2ml培养基，吹打均匀，用滴管吸入2-3个培养瓶，每个培养瓶补足培养基，放入培养箱继续培养。每1到2天换液一次，适时选择冻存细胞。
[0096]
2.1.3细胞冻存
[0097]
(1)酒精擦拭整理医学净化工作台，放入实验所需耗材消毒灭菌30分钟。
[0098]
(2)从37℃恒温培养箱取出正处于对数生长期的细胞，收集细胞液至离心管。
[0099]
(3)离心后弃上清，加入pbs清洗。
[0100]
(4)离心后弃上清，向离心管中加入1-1.5ml细胞冻存液，吹打成单细胞悬液，封口，管壁写上细胞名称，操作者姓名，日期，长期保存于80℃冰箱或者液氮中。
[0101]
2.1.4细胞计数
[0102]
细胞计数法使用血细胞计数板计数
[0103]
(1)计数前先用75％酒精洗涤擦拭计数板和盖玻片，确保计数板上无细胞。
[0104]
(2)将待测浓度的细胞悬液稀释1:100倍，方便计数。
[0105]
(3)混匀稀释细胞悬液，用移液枪抽取10ul细胞悬液，从侧边滴入玻璃板内。
[0106]
(4)倒置显微镜下观察，数计数板四个大方格中的细胞数目，重复测量3次，取平均值。
[0107]
(5)细胞数目/ml＝(4大格细胞数之和/4)
×
104×
稀释倍数。
[0108]
2.2cck-8实验
[0109]
(1)将装有raji细胞和jeko-1细胞的培养瓶从培养箱拿出，用滴管吸入15ml离心管，离心5min。
[0110]
(2)完全培养基重悬细胞，每孔加入104细胞加入96孔板。
[0111]
(3)加入不同浓度本发明中药组合物(解毒消瘤方)，每组设3个复孔，放入5％co2培养箱37℃孵育。
[0112]
(4)在12小时、24小时、48小时不同时间点，取出96孔板，离心2000rpm、5min，轻柔吸去上清，每孔加入10％cck-8的无血清培养基100ul，放入37℃，5％co2培养箱继续孵育1-4h。
[0113]
(5)取出六孔板在酶标仪上检测每孔细胞od值，吸光度450nm，按公式计算细胞存活率。
[0114]
2.3软琼脂集落形成实验
[0115]
(1)用ager配蒸馏水制备2.1％的ager溶液，高压灭菌后，放入70℃烘干箱。
[0116]
(2)下层胶：提前在37℃温热培养基，然后吸取温热好的培养基4.5ml到15ml的离心管中，并加入2.5ml agar溶液，配制成0.75％agar溶液，吹打混匀，迅速以1ml/孔加入6孔板，放置旁侧备用。
[0117]
(3)上层胶：5
×
103细胞充分混合900ul预热培养基和150ul ager溶液，再加入不同浓度的解毒消瘤方，在其细胞形态发生改变前快速放置在下层胶固化层之上。
[0118]
(4)每周一次添加培养基到每个孔中细胞。
[0119]
(5)三周后，菌落分为5个较大的随机区小于50μm进行拍照。
[0120]
2.4透射电镜下淋巴瘤细胞形态观察
[0121]
(1)将对数生长的raji细胞、jeko-1细胞吸入15ml离心管后，离心去上清，培养基重悬，2
×
106个/ml接种于6孔板。
[0122]
(2)加入4mg/ml本发明中药组合物(解毒消瘤方)，在含有5％co2的37℃培养箱内孵育24小时。
[0123]
(3)固定：将细胞用滴管吸入15ml离心管内，转速500g，离心5min成团(细胞团大小约半个至一个绿豆大小为宜)，随后去除大部分上清液(留1ml左右，切勿丢失细胞)，将离心管里的细胞轻轻吹散后转移到1.5ml的ep管内，垂直静置自然沉降1h后轻轻吸去上清液，再沿管壁缓缓加入1ml新预冷2.5％戊二醛，随后置于4℃冰箱固定保存。
[0124]
(4)漂洗：将淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞固定2小时及以上，后用0.1m磷酸洗15min
×
3次，1％锇酸固定液固定1-2小时，再用0.1m磷酸漂洗液洗15min
×
3次。
[0125]
(5)脱水：用不同梯度乙醇进行脱水，后用90％乙醇和90％丙酮(1:1)20min，90％丙酮20min，在4℃冰箱内进行，最后100％丙酮室温脱20min
×
3次。
[0126]
(6)包埋：纯丙酮 包埋液(2:1)室温4小时，纯丙酮 包埋液(1:2)室温过夜，纯包埋液37℃3小时。
[0127]
(7)固化：包埋后的细胞放入烘箱内过夜。
[0128]
(8)超薄切片机莱卡切片70nm。
[0129]
(9)2％醋酸铀-枸橼酸铅对淋巴瘤细胞进行双染色。
[0130]
(10)透射电镜下对淋巴瘤细胞进行观察，拍照。
[0131]
2.5细胞周期实验
[0132]
(1)将对数生长的淋巴瘤raji细胞、jeko-1细胞吸入15ml离心管后，离心去上清，培养基重悬，1
×
106个/ml接种于6孔板。
[0133]
(2)加入不同浓度的本发明中药组合物(解毒消瘤方)，在含有5％co2的37℃培养箱内孵育24h。
[0134]
(3)根据样本数量，计算所需要的染色工作液体积，每样本500μl工作液孵育；按rnasea:pi(1:9)配置工作液成染色工作液。
[0135]
(4)用pbs洗涤细胞一次(离心2000rpm，5min)收集并调整细胞浓度为1
×
106/ml，取1ml单细胞悬液。
[0136]
(5)制备的单细胞悬液离心后，去除上清，在细胞中加入体积分数为70％冷乙醇500ul固定(2时至过夜)，4℃保存，染色前用pbs洗去固定液。
[0137]
(6)加入提前配制好的500μl pi/rnase a(1:9)染色工作液，放入室温避光30-60min；后在流式仪上机检测。
[0138]
2.6细胞凋亡实验
[0139]
(1)将对数生长的raji细胞、jeko-1细胞吸入15ml离心管后，离心去上清，培养基重悬，2
×
105个/ml接种于6孔板。
[0140]
(2)加入不同浓度的本发明中药组合物(解毒消瘤方)，在含有5％co2的37℃培养箱内孵育24h。
[0141]
(3)收集细胞，重悬细胞，每组加1
×
缓冲液500ul重悬细胞，后加入5ul annexinv-fitc和5ul pi，混匀，室温、避光、15min。pbs清洗，离心。
[0142]
(4)弃上清，重悬细胞，后在流式仪进行上机检测。
[0143]
2.7rt-qpcr实验
[0144]
2.7.1细胞rna的提取
[0145]
(1)从六孔板中收集细胞于1.5ml ep管中，1000r离心5min，得到细胞沉淀，pbs洗两遍，加入1ml trizol在细胞内混匀，室温静置5min，裂解。
[0146]
(2)200μl氯仿加入后剧烈震荡10s，混匀后室温放置3min。
[0147]
(3)于4℃条件下12000g离心10min后分层，下层为红色，上层为无色水相，此时分三层：上层水相，中间蛋白层，下层为trizol 氯仿有机层，尽可能多的吸取上层水相，吸入另一个无酶的ep管中；rna主要在上层，吸取上层，小心不要吸取到中间层和下层。
[0148]
(4)加入同体积的异丙醇，上下摇晃颠倒，混匀后在室温静置2min。
[0149]
(5)离心：4℃、12000g、10min。
[0150]
(6)加入1ml 75％的乙醇，震荡混匀。
[0151]
(7)离心：4℃、7500g、5min。
[0152]
(8)去除乙醇，室温晾干。视沉淀量而加入30ul左右的defc水，溶rna。
[0153]
2.7.2rna浓度的测定
[0154]
(1)上机测定浓度及纯度。rna总量≥1ug，浓度35ng/μl，od260/280≥1.8。
[0155]
(2)depc水校零后，关闭机器，将rna浓度调整为500ng/ul。
[0156]
2.7.3逆转录
[0157]
(1)全程操作在冰上，取出primescripttm rt master mix(perfect real time)，按照说明加入八连管。
[0158]
表3逆转录试剂名称
[0159][0160][0161]
(2)按照上述内容快速加入，勿要产生气泡，离心使液体集中在底部
[0162]
(3)将96孔板置入逆转录机器中，设定反应条件：37℃15min，87℃5s，4℃∞。
[0163]
2.7.4扩增
[0164]
(1)上海生工生物工程有限公司设计提供引物，按照说明书溶解，并最终稀释成1
×
引物使用，引物序列如下，见表4；
[0165]
(2)整个操作置于冰上，取出tb green premix ex taptm，按照说明加入八连管，具体见表5；
[0166]
(3)按照上述内容快速加入，每个样品设置3个复孔，过程中切勿产生气泡，八连管扣上盖，轻压，离心使液体集中在底部；
[0167]
(4)将加样后的八连管放入机器中扩增，设定扩增程序，95℃30s，95℃5s，60℃
30s，95℃30s，40个循环，72℃检测信号。
[0168]
表4引物序列
[0169][0170]
表5扩增反应体系
[0171][0172][0173]
2.8蛋白免疫印迹(western blot)
[0174]
2.8.1溶液配制
[0175]
(1)电泳液：配置1l，先找一个配制个洁净的烧杯，将sds-page电泳液的粉剂倒入，加900ml蒸馏水，搅拌溶解，后定容到1l。
[0176]
(2)转膜液：配置1l，取转膜液的粉剂，倒入烧杯中，加入700ml蒸馏水，搅拌溶解，再加入200ml无水乙醇，混匀，在量筒中用蒸馏水定容到1l。
[0177]
(3)tbst：把20
×
tbst稀释成1
×
tbst缓冲液，然后按照20:1的比例加入，蒸馏水搅拌混匀，装入容器备用，常温保存。
[0178]
2.8.2蛋白样品制备及定量
[0179]
(1)从六孔板中收集细胞于1.5ml ep管中，离心去上清，pbs洗涤2次，向细胞沉淀中加100ul细胞裂解液，4℃裂解30min。
[0180]
(2)12000g离心15min；-20℃保存。
[0181]
(3)采用bca蛋白定量法测定：将a工作液与b工作液以50:1混合，每孔200ul，现配现用。
[0182]
(4)标准品孔：取一块96孔板，所有的蛋白放在冰盒上。标准品孔分别加入0、1、2、4、8、12、16、20μl稀释的蛋白液，每孔加入蒸馏水补齐至20μl。样品孔加入1μl待测液，19μl蒸馏水。蛋白最终浓度分别为0、0.0025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μl。
[0183]
(5)标准孔和样品孔均加入200μl bca工作液，注意不要有气泡，避光放入37℃恒温箱30min。
[0184]
(6)多功能酶标仪562nm检测，根据蛋白标准曲线来对蛋白浓度进行计算。
[0185]
2.8.3电泳
[0186]
(1)配胶：取出配胶装置，水平摆放在台面上，夹住玻璃板，倒入蒸馏水，检测装置是否有漏，若漏水，则及时更换玻璃板或者胶条或者配胶装置。根据雅酶快速胶说明书，取下层胶溶液4ml，下层胶缓冲液4ml，80μl改良型过硫酸铵溶液，混合，快速加入玻璃槽中，并快速在上层加入无水乙醇，动作要轻柔。30分钟后，下层胶凝固，倒去无水乙醇。后取上层胶溶液1ml，上层胶缓冲液1ml，20μl改良型过硫酸铵溶液混合，快速加入玻璃板内，插入梳子，过程切勿产生气泡。等待30分钟，上层胶凝固，便可使用。
[0187]
(2)取出sds-page胶电泳转膜装置，对其玻璃板卡紧后放入槽内，倒入电泳液，拔出上层胶的梳子，按照计算后上样。
[0188]
(3)盖上盖子后，正负极对准后插上电源。
[0189]
(4)调整电压为80v。
[0190]
2.8.4转膜
[0191]
(1)电泳结束后，pvdf膜依据胶的剪裁后在甲醇浸泡，活化1min。滤纸浸泡于转膜液中。
[0192]
(2)根据“黑胶白膜”，黑色夹板上叠放撤去玻璃的凝胶，并盖上pvdf膜，确保凝胶上样顺序与pvdf标记的位置一致；最后赶出气泡，合上夹子，装入转膜槽内。
[0193]
(3)转膜槽内倒入剩下预冷过的转膜液，盖上盖子，转膜槽周围全部用冰覆盖，对准电极，按200ma恒流电流。
[0194]
2.8.5封闭
[0195]
转膜结束后，关闭电源，打开转膜槽夹扣，用镊子轻柔将膜取出，蛋白面朝上，在左上角减去一小块做一标记，后轻慢加入quickblock western封闭液封闭，放入摇床上慢速摇30min。
[0196]
2.8.6抗体孵育及曝光
[0197]
(1)参照抗体说明书推荐稀释浓度，配置一抗。
[0198]
(2)将膜蛋白面滴加配置好的抗体，充分浸透pvdf膜，4℃孵育过夜。
[0199]
(3)膜取出，蛋白面朝上，缓慢加入tbst溶液，清洗10min
×
3次。
[0200]
(4)按照说明书稀释二抗，将膜蛋白面覆盖抗体上，充分浸透pvdf膜，避光常温敷1h或者37℃敷30min。
[0201]
(5)膜取出，蛋白面朝上，倒入tbst溶液，清洗10min
×
3次。
[0202]
(6)配制化学发光底物(ecl)，按照1:1的比例混合；膜蛋白面朝上，滴入化学发光底物，注意避光，不要有气泡，放入仪器检测。
[0203]
2.9.统计分析
[0204]
所有的统计计算使用graphpad7.0软件进行，所有结果都代表了至少有三次独立的实验。各组间差异采用单因素方差分析，p＜0.05有统计学意义。
[0205]
3结果
[0206]
3.1本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞的生长抑制作用
[0207]
以不同浓度的解毒消瘤方(0、1、2、4、8、16mg/ml)干预淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞不同时间段(12h、24h、48h)，采用cck-8检测细胞增殖(图1a)，结果发现与对照组相比，解毒消瘤方对两种细胞均有抑制作用，具有时间和浓度依赖性，淋巴瘤raji和jeko-1细胞用解毒消瘤方处理24h后半数抑制率(ic50)分别为4.06mg/ml和4.58mg/ml，后续实验采用1mg/ml、4mg/ml、8mg/ml进行。软琼脂集落形成结果(图1b)与cck-8结果一致，随着解毒消瘤方浓度的升高，细胞集落形成减少。
[0208]
3.2透射电镜下对淋巴瘤细胞形态的观察
[0209]
透射电镜下观察到淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞在解毒消瘤方处理24h后，细胞形态发生了改变。raji细胞对照组：细胞呈圆形，细胞外有少量突起(t)；细胞核(n)内常染色质丰富，核仁明显；细胞质较宽大，胞质内下立体(n)轻度肿胀，内脊梁清晰，粗面内质网(er)丰富(图2a)。raji加药组：细胞呈圆形，细胞外有少量突起(t)；细胞核(n)不规则，核内异染色质凝集；细胞质较宽大，胞质内线粒体(m)肿胀、大部分空泡，粗面内质网(er)丰富，凋亡小体(apb)易见(图2b)。jeko-1对照组：细胞呈圆形，细胞外有少量突起(t)；细胞核(n)稍不规则，细胞核内染色质丰富核仁明显；细胞质较宽大，细胞质内线粒体(m)轻度肿胀，内脊清晰，粗面内质网(er)易见(图2c)。jeko-1加药组：细胞形态不规则，胞质内可见胞膜包裹核内染色质及线粒体(m)等细胞器，形成明显的凋亡小体(图2d)。
[0210]
3.3本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞周期的影响
[0211]
我们采用不同浓度的解毒消瘤方(0、1、4、8mg/ml)处理raji细胞和jeko-1细胞24h后，流式检测不同浓度的解毒消瘤方对淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞周期的影响。如图2-3所示，raji细胞和jeko-1细胞随解毒消瘤方浓度升高，g2/m期比例上升，4mg/ml、8mg/ml与对照组相比，差异具有统计学意义(p＜0.05)，细胞阻滞在g2/m期，见图3、4。
[0212]
3.4本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤凋亡的影响
[0213]
不同浓度的解毒消瘤方(0、1、4、8mg/ml)处理raji细胞和jeko-1细胞24小时后，流式检测细胞的凋亡情况。结果显示，与对照组相比，fcm法检测不同浓度的解毒消瘤方对淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞凋亡的影响，1mg/ml的解毒消瘤方作用24h之后，变化不大，4mg/ml、8mg/ml的解毒消瘤方作用24h后，凋亡率显著提高。解毒消瘤方对淋巴瘤raji细胞凋亡率，对照组为(1
±
0.10％)、1mg/ml(10.10
±
0.25％)(p＜0.01)、4mg/ml(20.10
±
0.15％)(p＜0.001)、8mg/ml(36.10
±
0.25％)(p＜0.001)，解毒消瘤方对淋巴瘤jeko-1细胞凋亡率，对照组(1
±
0.15％)、1mg/ml(9.10
±
0.20％)(p＜0.01)、4mg/ml(14.10
±
0.28％)(p＜0.001)、8mg/ml(26.10
±
0.65％)(p＜0.001)，见图5。
[0214]
3.5本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞凋亡相关基因的影响
[0215]
与对照组相比，不同浓度的解毒消瘤方(0、1、4和8mg/ml)干预淋巴瘤细胞后，4mg/ml、8mg/ml解方凋亡基因caspase3、bax表达上调，抗凋亡基因表达下调，bax/bcl2比值上调，差异具有统计学意义，见图6。
[0216]
3.6本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞凋亡蛋白表达的影响
[0217]
我们采用western blot方法检测了解毒消瘤方对淋巴瘤raji细胞和jeko-1细胞bax、bcl2、caspase3蛋白的表达。如图2-6所示，随着解毒消瘤方浓度的增加，raji细胞和jeko-1细胞凋亡蛋白bax和caspase3蛋白表达上升，抗凋亡蛋白bcl2蛋白表达下调，bax/bcl2比值上调，见图7。
[0218]
4小结
[0219]
(1)本发明中药组合物(解毒消瘤方)可以抑制淋巴瘤细胞生长活性。
[0220]
(2)本发明中药组合物(解毒消瘤方)使淋巴瘤形态发生了改变，凋亡小体易见。
[0221]
(3)本发明中药组合物(解毒消瘤方)使淋巴瘤细胞周期阻滞在g2/m期，使淋巴瘤细胞凋亡率显著上升。
[0222]
(4)本发明中药组合物(解毒消瘤方)使淋巴瘤细胞凋亡分子bax、caspase3的mrna和蛋白表达上调，抗凋亡蛋白bcl2基因和蛋白表达下调。
[0223]
实施例17本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞移植瘤裸鼠的体内抑瘤实验
[0224]
1材料
[0225]
1.1实验动物及细胞株
[0226]
balb/c裸鼠，4-6周龄，体重量14
±
2g，雄性，spf级，从上海斯莱克有限公司购得，在上海市中医医院动物房适应环境一周开始造模等后续实验，整个实验遵循上海市中医医院伦理。人源burkit淋巴瘤raji细胞，购自中科院上海生命科学研究院细胞库。
[0227]
1.2实验用药
[0228]
本发明中药组合物(解毒消瘤方)：中药颗粒剂：购自江苏江阴天江药业有限公司，组成：夏枯草18g、紫花地丁15g、山慈菇9g、急性子9g、石见穿15g、三棱15g、薏苡仁30g、莪术15g、地骨皮18g、败酱草9g、知母9g、陈皮9g、姜半夏9g、白茯苓12g、鳖甲9g、甘草6g。根据人-鼠体表面积公式计算，换算出每组裸鼠灌胃所需剂量，溶解于蒸馏水，放入冰箱4℃保存。
[0229]
环磷酰胺溶液配制：将规格为0.2g注射用环磷酰胺(安道生)粉剂于避光条件下溶于0.9％氯化钠注射液中(配制成浓度为50mg/kg的ctx注射液)，现配现用。
[0230]
1.3主要试剂及耗材
[0231]
武汉俊杰电子脱水机(jj-12j)，武汉俊杰电子包埋机(jb-p5)，上海徕卡仪器的病理切片机(rm2016)，上海慧泰仪器制造有限公司烤箱(dhg-9140a)，日本尼康正置光学显微镜(nikon eclipse ci)。
[0232]
edta的柠檬酸(ph6.0)原修复液，批号为g1202；上海睿宝和生物科技有限公司的多聚甲醛(4％)，批号为r1001；国药集团化学试剂有限公司生产的二甲苯，批号为10023418；he染液套装，servicebio，批号：g1003；组化试剂盒dab显色剂，dak0，批号：k5007；中性树胶，servicebio，批号：g1403；bax抗体，cst，批号：14796；caspase3抗体，cst，批号：14220；bcl2抗体，cst，批号：3498。
[0233]
2实验方法
[0234]
2.1人淋巴瘤移植瘤裸鼠模型的建立
[0235]
2.1.1细胞培养
[0236]
细胞培养用内含10％fbs的1640完全培养基对人源burkit淋巴瘤raji细胞培养，处于37℃恒温、5％co2培养箱内。
[0237]
2.1.2构建人源burkit淋巴瘤raji细胞移植瘤模型
[0238]
细胞收集离心并计数，借助pbs重悬，对细胞浓度进行稀释，使得其达到1
×
108个/ml，对小鼠腋下近背部位置，注射200ul的细胞悬液，并确保整个过程处于无菌操作环境下。并每日去动物房观察动物状态以及瘤体的生长情况，待肿块成黄豆样大小时，开始每3天用
游标卡尺测量和记录淋巴瘤移植瘤体积。
[0239]
2.1.3动物分组
[0240]
造模后按照随机数字表法对淋巴瘤移植瘤裸鼠进行随机分为4组，每组5只，即为模型对照组(control)，解毒消瘤方低剂量组(low)、解毒消瘤方高剂量组(high)、环磷酰胺组(ctx)。
[0241]
2.1.4动物给药方法
[0242]
模型对照组(control)：予以生理盐水0.2m1/只/天；
[0243]
解毒消瘤方低剂量组(low)：浓度为4.25g/ml，0.2m1/只/天；
[0244]
解毒消瘤方高剂量组(high)(为低剂量组的2倍)：浓度为8.5g/ml，0.2m1/只/天；
[0245]
西药组(ctx)：50mg/kg，腹腔注射每周2次，每次0.2ml/只。
[0246]
2.1.5小鼠一般情况及生长曲线绘制
[0247]
记录裸鼠的测量值并根据公式对瘤体体积进行分析：v＝a
×
b2×
1/2(v＝瘤体体积、a＝瘤块最长直径、b＝最宽直径)。
[0248]
2.1.6淋巴瘤移植瘤瘤体质量
[0249]
给药21天，末次给药24小时到达实验终点，将小鼠脱颈处死，剥离瘤体，去除血迹，天平校零后称重。
[0250]
2.2对各组瘤体组织进行he染色
[0251]
2.2.1组织石蜡包埋切片实验步骤
[0252]
(1)取材：将瘤体取下修剪平整后立即放入4％多聚甲醛，固定在24h以上。(2)脱水：组织梯度脱水：50％
→
60％
→
70％乙醇4℃分别浸泡组织6min。(3)包埋：将浸好蜡的瘤体组织在包埋机内进行包埋。(4)切片：在切片机切成4um薄片，用恒温箱对其进行30分钟的烘干。
[0253]
2.2.2 he染色实验步骤
[0254]
(1)脱蜡：放入二甲苯两次，每次20min，再用100％、95％、90％、80％、70％梯度乙醇各1次，每次5min，后用蒸馏水洗涤。(2)苏木素染细胞核：苏木素染3-8min，蒸馏水洗，随即用盐酸乙醇(1％)分化处理，水洗反蓝。(3)伊红染细胞质：伊红染液持染1分钟再用流水加以冲洗。(4)脱水封片：将切片依次放入95％、100％乙醇各2次，每次5min，无水乙醇2次，二甲苯2次，每次5min，中性树胶封片。(5)显微镜镜检，图像采集分析。
[0255]
2.3免疫组化检测各组凋亡蛋白表达
[0256]
2.3.1切片脱蜡
[0257]
步骤同2.2.1实验部分。
[0258]
2.3.2免疫组化实验步骤
[0259]
(1)抗原修复：将组织切片置于盛满柠檬酸抗原热修，冷却后在pbs中洗3次。(2)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液，室温避光孵育30min，再次洗涤3次。(3)血清蛋白封闭：组化笔在组织周围画圈，滴入3％血清蛋白室温封闭30min。(4)一抗：滴加配好的一抗，4℃冰箱孵育过夜。(5)二抗：pbs洗3次，室温敷二抗1h。(6)dab显色：pbs洗3次，每次6-10min；加dab显色。(7)复染细胞核：清洗后苏木素染色。(8)脱水封片：放入75％、85％、100％乙醇脱水各6min，二甲苯通透5min，中性树胶封片。(8)显微镜观察瘤体组织颜色，扫描。(9)统计分析阳性标准：组织细胞阳性染色按照由弱到强可呈现黄色至棕黄色颗粒，不
显色为阴性；应用image-pro plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值(iod)，进行统计学分析。
[0260]
3结果
[0261]
3.1本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤移植瘤的抑瘤作用
[0262]
实验采用淋巴瘤raji细胞接种于balb/c裸小鼠右侧腋背部，建立淋巴瘤移植瘤模型。设模型对照组(生理盐水组)及阳性对照组(环磷酰胺)，实验组分别给予低剂量及高剂量解毒消瘤方进行灌胃。实验过程中每3天测量体重及移植瘤体积变化。在给药后第21天到达实验终点，对各组小鼠进行安乐死，剥离皮下肿瘤。
[0263]
结果显示与模型对照组相比，解毒消瘤方低剂量组的平均瘤体重量减轻(p＜0.05)，解毒消瘤方高剂量组的平均瘤体重量减轻(p＜0.01)，阳性对照组平均瘤体重量减轻(p＜0.01)。瘤体体积解毒消瘤方低剂量组、高剂量组，环磷酰胺组与对照组相比都有减轻，差异具有统计学意义(p＜0.01)。与模型对照组相比，解毒消瘤方低剂量组、解毒消瘤方高剂量组、阳性对照组体重无明显差别(p＞0.05)，见图8。
[0264]
3.2各组瘤体组织he染色
[0265]
细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，可见病理性核分裂，细胞核异型性明显，可见局灶性坏死。与阴性对照组相比，解毒消瘤方组和环磷酰胺阳性对照组组织坏死面积明显增加，细胞核破碎，裂解消失，留下残影，见图9。
[0266]
3.3免疫组化检测瘤体相关凋亡蛋白表达
[0267]
对各组瘤体用免疫组化检测凋亡相关蛋白阳性强度，与对照组相比，解毒消瘤方低剂量组、高剂量组、阳性对照组凋亡蛋白bax、caspase3表达上调、抗凋亡蛋白bc12下调，见图10、11。
[0268]
4.小结
[0269]
(1)本发明中药组合物(解毒消瘤方)对淋巴瘤细胞移植瘤的具有明显的抑瘤作用。
[0270]
(2)本发明中药组合物(解毒消瘤方)组和环磷酰胺阳性对照组的组织坏死面积明显增加，细胞核破碎，裂解消失，留下残影。
[0271]
(3)本发明中药组合物(解毒消瘤方)对凋亡蛋白bax、caspase3表达上调、抗凋亡蛋白bcl2下调。
[0272]
由于淋巴瘤是免疫细胞的恶性克隆，直接导致机体免疫功能的下降，属于因“毒”致“虚”，“毒”为其病机核心。邪气不散，必耗伤正气，故为“毒”。淋巴瘤的“毒邪”常由痰、瘀、热积聚变化而来。金
·
张子和在《儒门事亲
·
汗下吐三法该尽治病诠》有云：“夫病之一物，非人身素有也。或自外而入，或由内而生，皆邪气也。邪气加诸身
……
，先论攻其邪，邪去而元气自复也”，“良工之治病者，先治其实，后治其虚”。中医应用清热解毒、化痰祛瘀或以毒攻毒诸法治疗“毒邪”已有上千年历史。依据张子和之祛邪安正理论，我们采用以清热解毒攻邪为主的中药复方治疗淋巴瘤。
[0273]
方中夏枯草、山慈菇、石见穿均可清热、解毒、散结、消肿，共为君药；紫花地丁、急性子、鳖甲、生薏苡仁、三棱、莪术共为臣药，辅助君药以加强清热解毒、破瘀利湿、软坚散结之力；佐以陈皮、半夏、白茯苓、知母、地骨皮、败酱草以化痰、滋阴、凉血、解毒；以甘草为使，调和诸药；诸药合用，共奏清热解毒、健脾化痰、散结消癥之功。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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