季节性流感疫苗与基于腺病毒的呼吸道合胞病毒疫苗的共同施用的制作方法

1.本发明属于医学领域。特别地，本发明的实施例涉及基于腺病毒的疫苗及其与流感疫苗组合用于预防性治疗呼吸道合胞病毒(rsv)和流感病毒感染的用途。


背景技术：

2.呼吸道合胞病毒(rsv)被认为是婴儿和5岁以下儿童发生严重急性呼吸道疾病的最重要原因(hall等人,n engl j med[新英格兰医学杂志].2009:360；588-598；shay等人,jama[美国医学会杂志].1999:282；1440-1446；stockman等人,pediatr infect dis j[儿科传染病杂志].2012:31；5-9)。在全球范围内，每年估计有340万人因rsv而住院治疗。在美国，rsv感染导致5岁以下儿童每年有57,000至175,000人住院治疗、500,000人急诊、以及大约500人死亡(paramore等人,pharmacoeconomics[药物经济学].2004:22；275-284；shay等人,jama[美国医学会杂志].1999:282；1440-1446；stockman等人,pediatr infect dis j[儿科传染病杂志].2012:31；5-9)。在美国，60％的婴儿在首次暴露rsv后被感染(glezen等人,am j dis child[美国儿童疾病杂志].1986:140；543-546)，并且几乎所有儿童都在2-3岁之前感染过该病毒。对rsv的免疫是短暂的，并且在整个生命过程中会出现反复感染(hall等人,j infect dis[传染病杂志].1991:163；693-698)。在1岁以下儿童中，rsv是细支气管炎的最重要原因，并且6个月以下儿童的rsv住院率最高(疾病预防控制中心(centers for disease control and prevention，cdc).respiratory syncytial virus infection(rsv)-infection and incidence[呼吸道合胞病毒感染(rsv)-感染率和发病率].可获自：http://www.cdc.gov/rsv/about/infection.html(最近一次访问日期为2016年6月2日)；hall等人,n engl j med[新英格兰医学杂志].2009:360；588-598)。几乎所有5岁以下儿童的rsv相关死亡(99％)都发生在发展中国家(nair等人,lancet[柳叶刀].2010:375；1545-1555)。然而，在发达国家rsv引起的疾病负担也是巨大的，儿童期的rsv感染与喘息、气道高反应性和哮喘的发病相关(peebles等人,j allergy clin immunol[变态反应与临床免疫学杂志].2004:113；s15-18；regnier和huels,pediatr infect dis j[儿科传染病杂志].2013:32；820-826；sigurs等人,am j respir crit care med[美国呼吸与重症护理医学].2005:171；137-141；simoes等人,j allergy clin immunol[变态反应与临床免疫学杂志].2010:126；256-262；simoes等人,jpediatr[儿科学杂志].2007:151；34-42,42e31)。
[0003]
除儿童外，rsv也是老年人、免疫功能低下者和潜在慢性心肺病症患者的呼吸道感染的重要原因(falsey等人,n engl j med[新英格兰医学杂志].2005:352；1749-1759)。在长期护理机构中，估计rsv每年感染5％-10％的居民，肺炎发生率(10％至20％)和死亡率(2％至5％)显著(falsey等人,clin microbiol rev[临床微生物学评论].2000:13；371-384)。一项关于rsv负担的流行病学研究估计，在美国每年有11,000名老年人死于rsv(thompson等人,jama[美国医学会杂志].2003:289；179-186)。这些数据支持为某些成人群
体开发有效疫苗的重要性。
[0004]
可以使用针对rsv融合(f)糖蛋白的中和单克隆抗体([帕利珠单抗])进行被动免疫来预防，但这仅适用于早产儿(小于29周胎龄)、患有严重心肺疾病的儿童、或免疫功能严重低下者(美国儿科学会传染病委员会(american academy of pediatrics committee on infectious diseases),美国儿科学会细支气管炎指南委员会(american academy of pediatrics bronchiolitis guidelines committee).updated guidance for palivizumab prophylaxis among infants and young children at increased risk of hospitalization for respiratory syncytial virus infection[在因呼吸道合胞病毒感染而住院治疗的风险增加的婴幼儿中进行帕利珠单抗预防的最新指南].pediatrics[儿科学].2014:134；415-420)。已证明synagis可将住院治疗的风险降低55％(prevention.prevention of respiratory syncytial virus infections:indications for the use of palivizumab and update on the use of rsv-igiv[预防，呼吸道合胞病毒感染的预防：使用帕利珠单抗的适应症和使用rsv-igiv的情况更新].美国儿科学会传染病委员会及胎儿和新生儿委员会(american academy of pediatrics committee on infectious diseases and committee of fetus and newborn).pediatrics[儿科学].1998:102；1211-1216)。
[0005]
尽管疾病负担重并且对rsv疫苗开发存在强烈的兴趣，但没有可用于rsv的许可疫苗。二十世纪六十年代后期，开展了一系列研究以评估以明矾为佐剂的福尔马林灭活的rsv疫苗(fi-rsv)，并且这些研究的结果对rsv疫苗领域产生了重大影响。在不同年龄组的儿童中，对通过肌内注射给药的fi-rsv疫苗平行进行了四项研究(chin等人,am j epidemiol[美国流行病学杂志].1969:89；449-463；fulginiti等人,am jepidemiol[美国流行病学杂志].1969:89；435-448；kapikian等人,am j epidemiol[美国流行病学杂志].1969:89；405-421；kim等人,am j epidemiol[美国流行病学杂志].1969:89；422-434)。百分之八十的rsv感染的fi-rsv接受者需要住院治疗，并且在下一年冬季期间有两名儿童死亡(chin等人,am j epidemiol[美国流行病学杂志].1969:89；449-463)。rsv感染的对照组中只有5％的儿童需要住院治疗。已对fi-rsv接受者在再次感染后观察到的增强型呼吸道疾病(enhanced respiratory disease，erd)的机制进行了研究，并认为这是在该年龄组中存在小支气管的情况下异常免疫应答的结果。从患者样品和动物模型的分析中获得的数据表明，fi-rsv erd的特征在于，中和抗体滴度低、存在促进气道中免疫复合物沉积的低亲合力非中和抗体、经证明对病毒清除很重要的细胞毒性cd8 t细胞的引发(priming)减少、以及有嗜酸性粒细胞增多症迹象的cd4 t辅助性细胞2(th2)偏好的(skewed)应答增强(beeler等人,microb pathog[微生物发病机制].2013:55；9-15；connors等人,j virol[病毒学杂志].1992:66；7444-7451；de swart等人,j virol[病毒学杂志].2002:76；11561-11569；graham等人,j immunol[免疫学杂志].1993:151；2032-2040；kim等人,pediatr res[儿科学研究].1976:10；75-78；murphy等人,j clin microbiol[临床微生物学杂志].1986:24；197-202；murphy等人,jclin microbiol[临床微生物学杂志].1988:26；1595-1597；polack等人,j exp med[实验医学杂志].2002:196；859-865)。据认为，福尔马林和rsv蛋白抗原的化学相互作用可能是fi-rsv疫苗在随后的rsv感染后促进erd的机制之一(moghaddam等人,nat med[自然医学].2006:12；905-907)。由于这些原因，rsv疫苗开发中不再使用福尔马
林。
[0006]
除fi-rsv疫苗之外，在动物模型和人体研究中还对几种减毒活疫苗和亚单位rsv疫苗进行了考查，但许多疫苗因无法在安全性和免疫原性/疗效之间实现适当的平衡而受到抑制。减毒活疫苗特别受到与在婴儿中减毒过度和减毒不足相关的困难的挑战(belshe等人,j infect dis[传染病杂志].2004:190；2096-2103；karron等人,j infect dis[传染病杂志].2005:191；1093-1104；luongo等人,vaccine[疫苗].2009:27；5667-5676)。关于亚单位疫苗，rsv融合蛋白(f)和糖蛋白(g)蛋白都是膜蛋白，只有这两种rsv蛋白能诱导中和抗体(shay等人,jama[美国医学会杂志].1999:282；1440-1446)。与rsv g蛋白不同，f蛋白在rsv株系之间是保守的。基于已知的优越免疫原性、保护性免疫、以及f蛋白在rsv株系之间的高度保守性，已经开发了多种rsv f亚单位疫苗(graham,immunol rev[免疫学评论].2011:239；149-166)。由当前可用的抗f蛋白中和单克隆抗体预防提供的概念验证(proof-of-concept)支持以下观点：诱导高水平的长效中和抗体的疫苗可防止rsv疾病(feltes等人,pediatr res[儿科学研究].2011:70；186-191；groothuis等人,j infect dis[传染病杂志].1998:177；467-469；groothuis等人,nengl j med[新英格兰医学杂志].1993:329；1524-1530)。几项研究表明，老年人中针对rsv的保护降低可能是由于年龄相关的外周血单核细胞(pbmc)产生的干扰素γ(ifnγ)下降、cd8 t细胞与cd4 t细胞的比率降低、以及循环rsv特异性cd8 记忆t细胞的数目减少(de bree等人,j infect dis[传染病杂志].2005:191；1710-1718；lee等人,mech ageing dev[衰老与发育机制].2005:126；1223-1229；looney等人,j infect dis[传染病杂志].2002:185；682-685)。高水平的血清中和抗体与老年人感染程度减轻相关(walsh和falsey,j infect dis[传染病杂志].2004:190；373-378)。还证明，成人感染rsv后，血清抗体滴度迅速上升，但在16至20个月后缓慢恢复到感染前水平(falsey等人,j med virol[医学病毒学杂志].2006:78；1493-1497)。考虑到先前在二十世纪六十年代的fi-rsv疫苗研究中观察到erd，未来的疫苗应促进强烈的抗原特异性cd8 t细胞应答并且避免偏好的th2型cd4 t细胞应答(graham,immunol rev[免疫学评论].2011:239；149-166)。
[0007]
rsv f蛋白通过从不稳定的融合前构象到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒膜和宿主细胞膜融合。已经确定了rsv f两种构象的结构(mclellan等人,science[科学]2013:342,592-598；mclellan等人,nat struct mol biol[自然结构与分子生物学]2010:17,248-250；mclellan等人,science[科学]340,2013:1113-1117；swanson等人,proceedings of the national academy of sciences of the united states of america[美国国家科学院院刊]2011:108,9619-9624)以及来自相关副粘病毒的融合蛋白两种构象的结构，从而对这种复杂的融合机器的机制提供了深入认识。与其他i型融合蛋白一样，无活性前体(rsv f0)需要在细胞内成熟过程中通过弗林蛋白酶样蛋白酶进行切割。rsv f0含有两个弗林蛋白酶位点(例如，在genbank登录号为aco83301的rsv f0的氨基酸残基109/110和136/137之间)，这导致三种多肽：f2、p27和f1，其中后者在其n-末端含有疏水性融合肽(fp)。为了从融合前构象重折叠成融合后构象，重折叠区域1(rr1)(例如，在残基137和216之间，包括fp和七肽重复区域a(hra))必须从螺旋、环和链的组装转化成长的连续螺旋。然后，位于rr1的n-末端区段的fp能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接下来，在融合前f刺突中形成c-末端茎并包括七肽重复区域b(hrb)的重折叠区域2(rr2)
重新定位到rsv f的头部的另一侧，并且将hra卷曲螺旋三聚体与hrb结构域结合以形成六螺旋束。rr1卷曲螺旋的形成和rr2的重新定位以完成六螺旋束是在重折叠过程中发生的最显著的结构变化。
[0008]
人血清中的大多数中和抗体针对融合前构象，但是由于融合前构象的不稳定性，其具有在溶液中和在病毒粒子表面上过早重折叠成融合后构象的倾向。描述了在融合前构象中稳定化的rsv f多肽。参见，例如wo 2014/174018、wo 2014/202570和wo 2017/174564。然而，没有关于此类多肽在人体中的安全性、疗效/免疫原性的报告。
[0009]
流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸道疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重程度范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效应随流感株系的毒力以及宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变。据估计每年世界范围内有大约10亿人经历流感病毒感染，导致3百万至5百万例严重疾病，并且估计有300,000至500,000例流感相关死亡。
[0010]
存在三种属的流感病毒(甲型、乙型和丙型)，可导致人和动物的传染性病理。甲型和乙型病毒是导致在人中观察到的流感季节性流行病(甲型和乙型)和大流行病(甲型)的病原体。
[0011]
根据编码病毒附着和细胞释放分别所需的表面糖蛋白血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)的两个基因的抗原区域的变化，甲型流感病毒可分为多种流感病毒亚型。目前，已知甲型流感病毒有十六种ha亚型(h1-h16)和九种na抗原变体(n1-n9)。只有部分甲型流感亚型(即h1n1、h1n2和h3n2)在人群中传播，但16种ha和9种na亚型的所有组合都已在动物中(特别是在禽类中)发现。
[0012]
乙型流感病毒株系严格地是人株系。乙型流感病毒株系内ha中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的那些。乙型流感病毒的两种在遗传和抗原方面不同的谱系在人中传播，如由b/yamagata/16/88(也称为b/yamagata)和b/victoria/2/87(b/victoria)谱系所代表的(ferguson等人,nature[自然].2003年3月27日；422(6930):428-33.)。虽然由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但是对于乙型流感病毒感染仍经常观察到需要住院治疗的严重疾病。
[0013]
由于流感抗原的高度可变性和突变性，开发疫苗已被证明是困难的。然而，疫苗接种是针对疾病及其严重并发症进行保护的最有效方法。每年必须重新配制和重新施用疫苗，以预测每个流感季节预计会在群体中流行的病毒血清型，因此被视为“季节性”疫苗。典型地，最常见的人疫苗是一种代表性株系的组合，该株系来自主要导致自1977年以来每年全球流感爆发的主要病毒类型中的每一种(包括甲型(h1n1)、甲型(h3n2)和乙型)。存在两类流感疫苗，包括通过肌内(im)注射给6个月及以上个体的三价灭活疫苗(tiv)，以及鼻内施用给2-49岁的健康未孕人士的流感病毒减毒活疫苗(laiv)。
[0014]
易受rsv感染的群体通常也易受流感病毒感染。因此，需要一种在有需要的受试者中共同施用针对rsv的疫苗和针对流感病毒的疫苗的安全有效的方法。


技术实现要素：

[0015]
在一个一般方面，本技术描述了一种在有需要的人受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(rsv)感染的保护性免疫应答和针对流感病毒感染的保护性免疫应答两者的方法，该
方法包括向该受试者肌内施用(a)有效量的包含腺病毒载体的药物组合物，优选疫苗，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸，其中该有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
10
至约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体；以及(b)有效量的流感疫苗，其中(a)和(b)共同施用。
[0016]
在某些实施例中，(a)的药物组合物和(b)的疫苗同时施用。
[0017]
在某些实施例中，腺病毒载体无复制能力，并且在腺病毒早期区域1(e1区域)和早期区域3(e3区域)中的至少一个中具有缺失。
[0018]
在某些实施例中，腺病毒载体是具有e1区域和e3区域的缺失的、无复制能力的ad26腺病毒载体。
[0019]
在某些实施例中，腺病毒载体是具有e1区域和e3区域的缺失的、无复制能力的ad35腺病毒载体。
[0020]
在某些实施例中，由腺病毒载体编码的重组rsv f多肽具有seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列。
[0021]
在某些实施例中，编码rsv f多肽的核酸包含seq id no:6或seq id no:7的多核苷酸序列。
[0022]
在某些实施例中，有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
11
个病毒颗粒的腺病毒载体。
[0023]
在某些实施例中，流感疫苗是季节性流感疫苗。
[0024]
在某些实施例中，受试者易受rsv感染。
[0025]
在某些实施例中，受试者易受流感病毒感染。
[0026]
在某些实施例中，保护性免疫应答的特征在于，在暴露于rsv后，受试者不存在rsv临床症状或rsv临床症状减轻。
[0027]
在某些实施例中，保护性免疫应答的特征在于，在暴露于流感病毒后，受试者不存在流感病毒临床症状或流感病毒临床症状减轻。
[0028]
在某些实施例中，保护性免疫应答的特征在于对抗rsv的中和抗体和/或针对rsv的保护性免疫。
[0029]
在某些实施例中，保护性免疫应答的特征在于对抗流感病毒的中和抗体和/或针对流感病毒的保护性免疫。
[0030]
在某些实施例中，该施用不诱导任何严重不良事件。
[0031]
在一个一般方面，本技术描述了一种组合如试剂盒，该组合包含：(a)含有腺病毒载体的药物组合物，优选疫苗，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸，其中有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
10
至约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体；以及(b)流感疫苗，优选季节性流感疫苗。该组合可用于在有需要的人受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(rsv)感染的保护性免疫应答和针对流感病毒感染的保护性免疫应答两者。
附图说明
[0032]
当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本技术的优选实施例的以下详细描述。然而，应当理解，本技术不限于附图中所示的精确实施例。
[0033]
图1示出了符合方案(per-protocol)流感免疫原性群体疫苗接种后28天的血凝抑制(hi)抗体应答(hai)的几何平均比率的森林图；
[0034]
图2示出了符合方案流感免疫原性群体的hi抗体应答(hai)随时间推移的平均(95％ci)实际值的图；
[0035]
图3示出了符合方案流感免疫原性群体疫苗接种后28天的hi抗体应答(hai)的血清转化差的森林图；
[0036]
图4示出了符合方案流感免疫原性群体疫苗接种后28天的hi抗体应答(hai)的血清保护差的森林图；
[0037]
图5示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的对抗rsv a2株系的中和抗体滴度图，图中示出了几何平均数及95％ci，并且n＝具有基线数据的受试者数量；
[0038]
图6示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的如通过elisa测量的由rsv pre-f蛋白引起的抗体应答的图，图中示出了几何平均数及95％ci，并且n＝具有基线数据的受试者数量；
[0039]
图7示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的如通过elisa测量的由rsv post-f蛋白引起的抗体应答的图，图中示出了几何平均数及95％ci，并且n＝具有基线数据的受试者数量；以及
[0040]
图8示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的如通过ifn-γelispot测定法测量的rsv-f特异性t细胞应答的箱形图。
具体实施方式
[0041]
在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一项通过援引以其全文并入本文。包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、制品等的讨论是为了提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
[0042]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。
[0043]
必须注意，如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。
[0044]
除非另有说明，否则任何数值(如本文所述的浓度或浓度范围)应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值通常包括列举值的
±
10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则数值范围的使用明确包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括值的此类范围内的整数和分数。
[0045]
除非另外指明，否则在一系列要素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验便确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同方案。这些等同方案也旨在包括在本发明中。
[0046]
如本文所用，术语“包含(comprises、comprising)”、“包括(includes、including)”、“具有(has、having)”、“含有(contains或containing)”或它们的任何其他变
化，将被理解为意味着包括所述整数或整数组，而不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放性的。例如，包含要素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不一定仅限制于那些要素，而可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的其他要素。此外，除非明确地说明是相反的，否则“或”是指包括在内的或，而不是指排他性的或。例如，条件a或b由以下项中的任一项满足：a为真(或存在)并且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)并且b为真(或存在)，以及a和b二者都为真(或存在)。
[0047]
应当理解，当提及优选发明的组分的规格或特征时，本文使用的术语“约”、“大约”、“大致”、“基本”和类似术语指示描述的规格/特征不是严格的界限或参数，并且不从其排除功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的那样。至少，包括数值参数的此类提及将包括使用本领域接受的数学和工业原理(例如舍入误差、测量误差或其他系统误差、制造公差等)不会改变最低有效位数的变化。
[0048]
本发明提供了在有需要的人受试者中诱导针对呼吸道合胞病毒(rsv)感染的保护性免疫应答和针对流感病毒的保护性免疫应答两者的方法，这些方法包括向该受试者肌内施用：(a)有效量的包含腺病毒载体的药物组合物，优选疫苗，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸；以及(b)有效量的流感疫苗。
[0049]
如本文所用，术语“rsv融合蛋白”、“rsv f蛋白”、“rsv融合多肽”或“rsv f多肽”是指任何组、亚组、分离物、类型或株系的呼吸道合胞病毒(rsv)的融合(f)蛋白。rsv作为具有两个抗原亚组a和b的单一血清型存在。rsv f蛋白的实例包括但不限于来自rsv a的rsv f(例如rsv a1 f蛋白和rsv a2 f蛋白)以及来自rsv b的rsv f(例如rsv b1 f蛋白和rsv b2 f蛋白)。如本文所用，术语“rsv f蛋白”包括包含突变的蛋白质，例如，全长野生型rsv f蛋白的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
[0050]
根据特定的实施例，在融合前构象中稳定化的rsv f多肽源自rsv a株系。在某些实施例中，rsv f多肽源自rsv a2株系。与野生型rsv f蛋白相比，特别是与具有seq id no:1的氨基酸序列的rsv f蛋白相比，可用于本发明的在融合前构象中稳定化的rsv f多肽是具有至少一个突变的rsv f蛋白。根据特定的实施例，可用于本发明的在融合前构象中稳定化的rsv f多肽包含选自由k66e、n67i、i76v、s215p、k394r、s398l、d486n、d489n、和d489y组成的组的至少一个突变。
[0051]
根据特定的实施例，在融合前构象中稳定化的rsv f多肽包含由融合前特异性单克隆抗体(例如cr9501)识别的至少一个表位。cr9501包含在wo 2011/020079和wo 2012/006596中称为58c5的抗体的结合区域，该cr9501与呈融合前构象的rsv f蛋白特异性结合，而不与呈融合后构象的rsv f蛋白结合。
[0052]
在特定的实施例中，rsv f多肽进一步包含连接至截短的f1结构域的异源三聚化结构域，如在wo 2014/174018和wo 2014/202570中所述。如本文所用，“截短的”f1结构域是指不是全长f1结构域的f1结构域，即其中在n-末端或在c-末端一个或多个氨基酸残基已经缺失。根据特定的实施例，至少跨膜结构域和胞质尾区(cytoplasmic tail)已经缺失以允许表达为可溶性胞外结构域。在某些实施例中，三聚化结构域包含seq id no:2，并且直接或通过接头连接至rsv f1结构域的氨基酸残基513。在某些实施例中，接头包含氨基酸序列saig(seq id no:3)。
[0053]
在融合前构象中稳定化的rsv f蛋白的实例包括但不限于wo 2014/174018、
wo2014/202570和wo 2017/174564中描述的那些，这些文献的内容通过援引并入本文。
[0054]
根据特定的实施例，rsv f蛋白包含seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列具有至少75％、80％、95％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
[0055]
编码在融合前构象中稳定化的rsv f蛋白的核酸的实例包括seq id no:6和seq id no:7。本领域技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子可以编码相同的多肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术产生不影响由其中描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映有待表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核酸分子”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和rna的核苷酸序列可以包括内含子。按本领域中的惯例，从5'至3'方向提供了本文中的序列。
[0056]
流感病毒分为以下流感病毒类型：甲型、乙型和丙型。如本文所用，术语“流感病毒”是指任何甲型、乙型或丙型流感病毒以及其中的任何亚型。甲型流感病毒变体通过血凝素(h)和神经氨酸酶(n)病毒表面蛋白的组合进一步表征为多种亚型。如本文所用，人流感病毒株系或分离物的命名法包括病毒的类型(属)(即甲型、乙型或丙型)和首次分离的地理位置，例如a/密歇根州(michigan)、a/香港、b/布里斯班(brisbane)、b/普吉岛(phuket)等。
[0057]
如本文所用，术语“疫苗”是指一种含有活性组分的组合物，该组合物可有效诱导受试者对某种病原体或疾病产生一定程度的免疫，从而使得与该病原体或该疾病感染相关的症状的严重程度、持续时间或其他表现形式至少降低，以及直至完全消失。在本发明中，疫苗包含腺病毒，该腺病毒包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸。根据本技术的实施例，疫苗可用于在受试者中防止导致住院治疗的严重下呼吸道疾病，并且降低由rsv感染和复制引起的并发症(如肺炎和细支气管炎)的频率。在某些实施例中，疫苗可以是一种组合疫苗，其进一步包含诱导保护性免疫应答(例如针对rsv的其他蛋白质和/或针对其他感染原)的其他组分。另外的活性组分的施用可以例如通过单独施用或通过施用本发明的疫苗与另外的活性组分的组合产物来进行。
[0058]
在某些实施例中，流感疫苗是季节性流感疫苗，其定义为针对流感季节中季节性发生的流感病毒的疫苗。季节性流感疫苗的实例包括但不限于三价a/h1n1-a/h3n2 b疫苗。在某些实施例中，季节性流感疫苗可以是任何可商购的季节性流感疫苗。可商购的季节性流感疫苗的实例包括，例如，裂解疫苗(split vaccine)begrivac
tm
(惠氏公司(wyath))、fluarix
tm
(葛兰素史克公司(gsk))、fluzone
tm
(赛诺菲公司(sanofi))、和flushield
tm
(健美生公司(jamieson))；亚单位疫苗fluvirin
tm
(塞奇鲁斯公司(seqirus))、agrippal
tm
(诺华公司(novartis))、和influvac
tm
(雅培公司(abbott))；以及流感病毒减毒活疫苗flumist
tm
(英商梅迪缪思有限公司(medimmune inc.))。
[0059]
如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指接种疫苗的受试者能够控制疫苗接种所针对的致病因子的感染。通常，已经出现了“保护性免疫应答”的受试者仅出现轻度至中度临床症状或根本没有症状。通常，对某种因子具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会由于该因子的感染而死亡。
[0060]
如本文所用，术语“诱导”及其变体是指细胞活性的任何可测量的增加。保护性免疫应答的诱导可包括例如免疫细胞群体的激活、增殖或成熟，增加细胞因子的产生，和/或
增加的免疫功能的另一指标。在某些实施例中，免疫应答的诱导可包括增加b细胞的增殖，产生抗原特异性抗体，增加抗原特异性t细胞的增殖，改善树突状细胞抗原呈递，和/或增加某些细胞因子、趋化因子和共刺激标志物的表达。
[0061]
可以使用本领域标准的多种测定法在体外或体内评估诱导针对rsv f蛋白和/或针对流感病毒的保护性免疫应答的能力。有关可用于评估免疫应答的发生和激活的技术的一般说明，请参见例如coligan等人(1992和1994,current protocols in immunology[当代免疫学实验手册]；j wiley&sons inc[约翰&威利父子公司]编辑,national institute of health[国家卫生研究所])。可以通过本领域公知的方法，例如，通过测量由激活的效应细胞(包括源自cd4 t细胞和cd8 t细胞的那些)分泌的细胞因子谱(例如，通过elispot对产生il-4或ifnγ的细胞进行定量)，通过测量pbmc增殖，通过测量nk细胞活性，通过确定免疫效应细胞的激活状态(例如，通过经典[3h]胸苷摄入法(classical[3h]thymidine uptake)进行的t细胞增殖测定)，通过测定致敏受试者中的抗原特异性t淋巴细胞(例如，在细胞毒性测定中的肽特异性裂解等)，来测量细胞免疫。另外，可以在免疫后的不同时间测量血液中具有针对局部位点的归巢标志物(homing marker)的igg和iga抗体分泌细胞，这些归巢标志物可以指示向肠道、肺和鼻组织的运输，作为局部免疫的指示，并且可以测量鼻分泌物中的igg和iga抗体；可以表征抗体的fc功能以及抗体与细胞(如pmn、巨噬细胞和nk细胞)或与补体系统相互作用的测量；并且可以使用单细胞rna测序分析来分析b细胞库和t细胞库。
[0062]
诱导针对rsv f蛋白和/或针对流感病毒的保护性免疫应答的能力可以通过检测来自受试者的生物样品(例如，鼻洗液、血液、血浆、血清、pbmc、尿液、唾液、粪便、脑脊髓液、支气管肺泡灌洗液或淋巴液)中是否存在针对组合物中施用的一种或多种rsv f蛋白的抗体(例如igg或igm抗体)来确定，这些抗体是例如针对rsv a2的病毒中和抗体(vna a2)、vna rsv a memphis 37b、rsv b pre-f抗体、post-f抗体、rsv ga抗体、rsv gb抗体(参见，例如harlow,1989,antibodies[抗体],cold spring harbor press[冷泉港出版社])；或者例如是否存在针对流感病毒疫苗中施用的一种或多种流感病毒蛋白的igg或igm抗体来确定，这些抗体是例如血凝抑制(hi)或微中和(mn)抗体。例如，响应于提供免疫原的组合物的施用而产生的抗体滴度可通过以下测量：酶联免疫吸附测定(elisa)，其他基于elisa的测定(例如，msd-meso scale discovery测定)，斑点印迹(dot blots)，sds-page凝胶，elispot，fc与补体、pmn、巨噬细胞和nk细胞相互作用(有或没有补体增强)的测量，或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)测定。示例性方法在实例1中描述。根据特定的实施例，诱导的免疫应答的特征在于对抗rsv的中和抗体和/或针对rsv的保护性免疫。根据特定的实施例，诱导的免疫应答的特征在于对抗流感病毒的中和抗体和/或针对流感病毒的保护性免疫。
[0063]
根据特定的实施例，保护性免疫应答的特征在于存在对抗rsv的中和抗体和/或针对rsv的保护性免疫，优选地在施用药物组合物后8天至35天，例如在施用药物组合物后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天可检测到。更优选地，在施用免疫原性组分后约6个月至5年，例如在施用免疫原性组分后6个月、1年、2年、3年、4年或5年，检测针对rsv的中和抗体。
[0064]
根据特定的实施例，保护性免疫应答的特征在于存在对抗流感病毒的中和抗体和/或针对流感病毒的保护性免疫，优选地在施用药物组合物后8天至35天，例如在施用药物组合物后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34或35天可检测到。更优选地，在施用免疫原性组分后约6个月至5年，例如在施用免疫原性组分后6个月、1年、2年、3年、4年或5年，检测针对流感的中和抗体。
[0065]
根据特定的实施例，在共同施用(a)和(b)后诱导的针对rsv的保护性免疫应答的特征在于与在仅施用(a)后诱导的针对rsv的保护性免疫应答相比的非劣效性。根据特定的实施例，在共同施用(a)和(b)后诱导的针对流感病毒的保护性免疫应答的特征在于与在仅施用(b)后诱导的针对流感病毒的保护性免疫应答相比的非劣效性。如本文所用，非劣效性是使用rsv特异性抗体或流感病毒特异性抗体的几何平均滴度(gmt)的界值(margin)2来确定的。示例性方法在实例1中描述。
[0066]
根据特定的实施例，保护性免疫应答的特征在于，在暴露于rsv后，受试者不存在rsv临床症状或rsv临床症状减轻。根据特定的实施例，保护性免疫应答的特征在于，在暴露于流感病毒后，受试者不存在流感病毒临床症状或流感病毒临床症状减轻。rsv和流感临床症状包括例如上呼吸道症状，包括例如流鼻涕、鼻塞、打喷嚏、喉咙痛、耳痛；下呼吸道症状，包括例如咳嗽、气短、胸闷、喘息、咳痰；以及全身症状，包括例如不适、头痛、肌肉疼痛和/或关节疼痛、发冷/发烧。
[0067]
如本文所用，术语“不良事件(ae)”是指在施用药物产品的患者中发生的任何不利的医学事件，并且不一定与治疗具有因果关系。根据本发明的实施例，使用以下定义按严重程度增加的4点量表对ae进行评级：轻度(1级)：不干扰活动；中度(2级)：对活动有一定的干扰，不需要医疗干预；严重(3级)：妨碍日常活动并需要医疗干预；潜在危及生命(4级)：症状导致无法执行基本的自我护理功能或指示医疗或手术干预以防止永久性损伤、持续性残疾。“严重不良事件”、“严重ae”、“sae”可以是在任何剂量下发生的导致任何以下结果的任何ae：死亡，其中死亡是一个结果，而不是一个事件；危及生命，指事件发生时患者有死亡风险的事件，它不是指假设情况更严重时可能导致死亡的事件；住院患者的住院治疗，即计划外的、过夜的住院治疗或现有住院治疗的时间延长；进行正常生活功能的能力持续或显著丧失或严重破坏；先天性异常/出生缺陷；可能危及患者或可能需要医疗或手术干预以防止上面列出的其他结果之一(例如，在急诊室或在家中对不会导致住院治疗的过敏性支气管痉挛或血液恶病质(blood dyscrasias)或抽搐进行强化治疗)的重要医疗事件(如研究者所认为的)。住院治疗是正式入院。住院治疗或住院治疗的时间延长构成严重ae的标准，然而，它本身并不被视为sae。在不存在ae的情况下，住院治疗或住院治疗的时间延长不被视为sae。在以下情况下可能是这种情况：方案要求的程序需要住院治疗或住院治疗的时间延长；或者住院治疗或住院治疗的时间延长是中心遵循的常规程序的一部分(例如，手术后移除支架)。对在研究期间未恶化的既往病症进行选择性治疗而采取的住院治疗不被视为ae。住院治疗期间发生的并发症是ae。如果并发症延长住院治疗时间或符合任何其他sae标准，则该事件为sae。
[0068]
如本文所用，术语“有效量”是指在受试者中引发所希望的生物或药物反应的活性成分或组分的量。基于几个因素的考虑，包括待治疗或待防止的疾病、所涉及的症状、患者的体质、患者的免疫状态以及熟练的技术人员已知的其他因素，本领域技术人员可以确定(例如，经由临床试验)特定有效剂量的选择。配制品中待采用的精确剂量还将取决于施用方式、施用途径、靶位点、患者的生理状态、所施用的其他药物和疾病的严重程度。例如，药物组合物的有效量还取决于是否还施用佐剂，在不存在佐剂的情况下需要更高的剂量。
[0069]
根据本技术的实施例，药物组合物的有效量包含足以诱导针对rsv f蛋白的保护性免疫应答而不诱导严重不良事件的药物组合物的量。在特定的实施例中，有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
10
至约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体，优选地每剂量约1x10
11
个病毒颗粒的腺病毒载体，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸。
[0070]
根据本技术的实施例，有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
10
至约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体，例如每剂量约1x10
10
个病毒颗粒、每剂量约2x10
10
个病毒颗粒、每剂量约3x10
10
个病毒颗粒、每剂量约4x10
10
个病毒颗粒、每剂量约5x10
10
个病毒颗粒、每剂量约6x10
10
个病毒颗粒、每剂量约7x10
10
个病毒颗粒、每剂量约8x10
10
个病毒颗粒、每剂量约9x10
10
个病毒颗粒、每剂量约1x10
11
个病毒颗粒、每剂量约2x10
11
个病毒颗粒、每剂量约3x10
11
个病毒颗粒、每剂量约4x10
11
个病毒颗粒、每剂量约5x10
11
个病毒颗粒、每剂量约6x10
11
个病毒颗粒、每剂量约7x10
11
个病毒颗粒、每剂量约8x10
11
个病毒颗粒，每剂量约9x10
11
个病毒颗粒、或每剂量约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸。优选地，重组rsv f多肽具有seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列，并且腺病毒载体为血清型26的腺病毒载体，如重组ad26。
[0071]
根据本技术的实施例，流感病毒疫苗的有效量包含足以诱导针对流感病毒的保护性免疫应答而不诱导严重不良事件的流感病毒疫苗的量。在特定的实施例中，有效量的流感病毒疫苗包含单一剂量的可商购的季节性流感病毒疫苗。
[0072]
根据特定的实施例，人受试者易受rsv感染。在某些实施例中，易受rsv感染的人受试者包括但不限于老年人受试者，例如≥50岁、≥60岁、优选地≥65岁的人受试者；年轻人受试者，例如≤5岁、≤1岁的人受试者；和/或已住院治疗的人受试者或接受过抗病毒化合物治疗但显示抗病毒应答不足的人受试者。
[0073]
根据特定的实施例，人受试者易受流感病毒感染。在某些实施例中，易受流感病毒感染的人受试者包括但不限于老年人受试者，例如≥50岁、≥60岁、优选地≥65岁的人受试者；年轻人受试者，例如≤5岁、≤1岁的人受试者；和/或已住院治疗的人受试者或接受过抗病毒化合物治疗但显示抗病毒应答不足的人受试者。在某些实施例中，易受rsv感染的人受试者包括但不限于患有慢性心脏病、慢性肺病、和/或免疫缺陷的人受试者。
[0074]
根据特定的实施例，向有需要的人受试者施用包含腺病毒的药物组合物和流感疫苗，该腺病毒包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸分子。
[0075]
在某些实施例中，腺病毒是人重组腺病毒，也称为重组腺病毒载体。重组腺病毒载体的制备在本领域是熟知的。如本文所用，针对腺病毒的术语“重组”暗示它已被人工修饰，例如其具有在其中以保持活性地克隆的经改变的末端和/或其包含异源基因，即它不是天然存在的野生型腺病毒。
[0076]
在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在病毒复制必需的腺病毒基因组的el区域(例如，ela区域和/或elb区域)的至少一个必需基因功能上是有缺陷的。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必需e3区域的至少部分上是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在el区域的至少一个必需基因功能上以及在非必需e3区域的至少部分上是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述el缺陷的腺病毒载
体，或e1、e3缺陷的腺病毒载体可以进一步在e4区域的至少一个必需基因和/或e2区域(例如，e2a区域和/或e2b区域)的至少一个必需基因上是有缺陷的。
[0077]
腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法是本领域所熟知的，并且描述于例如美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、和6,113,913，以及thomas shenk,“adenoviridae and their replication”[腺病毒及其复制],m.s.horwitz,“adenoviruses”[腺病毒],分别第67和68章，见于virology[病毒学],b.n.fields等人编，第3版，纽约雷文出版社有限公司(raven press,ltd.,new york)(1996)，以及本文提及的其他参考文献。典型地，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物技术，例如描述在以下中的那些：例如sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual[分子克隆，实验室手册]，第2版，cold spring harbor press[冷泉港出版社],冷泉港,纽约(1989)，watson等人,recombinant dna[重组dna],第2版,scientific american books[科学美国人书籍](1992)，和ausubel等人,current protocols in molecular biology[现代分子生物方法],wiley interscience publishers[威立跨科学出版社],纽约(1995)，以及本文提到的其他参考文献。
[0078]
在某些实施例中，腺病毒是血清型26或35的人腺病毒。
[0079]
rad26载体的制备描述于例如wo 2007/104792以及abbink等人,virol[病毒学].2007:81(9):4654-63中。ad26的示例性基因组序列发现于genbank登录号ef 153474以及wo 2007/104792的seq id no:l中。rad35载体的制备描述于例如美国专利号7,270,811、wo 00/70071以及vogels等人,j virol[病毒学杂志].2003:77(15):8263-71中。ad35的示例性基因组序列发现于genbank登录号ac 000019和wo 00/70071的图6中。
[0080]
根据本发明的重组腺病毒可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组的el区域中含有缺失。如技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须优选的是由生产细胞反式提供，即，当el、e2和/或e4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些区域必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或呈所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在e3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，因此不必补充这种缺失。
[0081]
在某些实施例中，腺病毒是无复制能力的腺病毒。根据特定的实施例，腺病毒是无复制能力的ad26腺病毒。根据特定的实施例，腺病毒是无复制能力的ad35腺病毒。
[0082]
可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文中也被称为“包装细胞”或“补充细胞”或“宿主细胞”)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，这些生产细胞补充腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒el序列，并因而能够补充在el区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充el的生产细胞，例如由el永生化的人视网膜细胞，例如911或per.c6细胞(参见，美国专利5,994,128)、el转化的羊水细胞(参见，欧洲专利1230354)、el转化的a549细胞(参见，例如wo 98/39411、美国专利5,891,690)、gh329:hela(gao等人,human gene therapy[人基因疗法]2000:11:213-219)、293等。在某些实施例中，生产细胞是例如hek293细胞、或per.c6细胞、或911细胞、或it293sf细胞等。
[0083]
对于非亚组c el缺陷的腺病毒，例如ad35(亚组b)或ad26(亚组d)，优选地是将这
些非亚组c腺病毒的e4-orf6编码序列与亚组c的腺病毒(例如ad5)的e4-orf6进行交换。这允许在表达ad5的el基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如像293细胞或per.c6细胞(参见，例如havenga等人,j.gen.virol[普通病毒学杂志].2006:87:2135-2143；wo 03/104467，将其通过援引以其全文并入本文)。在某些实施例中，可以使用的腺病毒是血清型35的人腺病毒，其具有已经将编码rsv f蛋白抗原的核酸克隆到其中的el区域中的缺失，并具有ad5的e4 orf6区域。在某些实施例中，本发明的疫苗组合物中的腺病毒是血清型26的人腺病毒，其具有已经将编码rsv f蛋白抗原的核酸克隆到其中的el区域中的缺失，并具有ad5的e4 orf6区域。
[0084]
在替代性实施例中，不需要将异源(例如ad5的)e4orf6区域置于腺病毒载体中，但是需要el缺陷的非亚组c载体在表达el和相容的e4orf6两者的细胞系(例如，表达来自ad5的el和e4orf6两者的293-orf6细胞系)中繁殖(参见，例如brough等人,j virol[病毒学杂志].1996:70:6497-501，其描述了293-orf6细胞的产生；abrahamsen等人,j virol[病毒学杂志].1997:71:8946-51以及nan等人,gene therapy[基因疗法]2003:10:326-36，各自描述了使用这种细胞系产生el缺失的非亚组c腺病毒载体)。
[0085]
可替代地，可以使用从待繁殖的血清型表达el的补充细胞(参见，例如wo00/70071、wo 02/40665)。
[0086]
对于在el区域具有缺失的亚组b腺病毒(例如ad35)，优选地是将e1b 55k开放阅读框的3’端保留在腺病毒中，例如pix开放阅读框直接上游的166bp或包含该166bp的片段，例如pix起始密码子直接上游的243bp的片段(在5
‘
端由ad35基因组中的bsu36l限制性位点标记)，因为pix基因的启动子部分驻留在该区，这增加了腺病毒的稳定性(参见，例如havenga等人,2006,j.gen.virol.[普通病毒学杂志]87:2135-2143；wo 2004/001032，将其通过援引并入本文)。
[0087]
根据熟知的方法，可以在宿主细胞中制备和繁殖重组腺病毒，这些方法需要用腺病毒感染的宿主细胞的细胞培养物。细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。
[0088]
根据特定的实施例，用于本发明的药物组合物进一步包含药学上可接受的载剂或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们施用的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域熟知的(参见remington’s pharmaceutical science[雷明顿制药科学](第15版),mack publishing company[麦克出版公司],easton,pa.[宾夕法尼亚州伊斯顿],1980)。药物组合物的优选配制品取决于预期的施用方式和治疗应用。组合物可以包括药学上可接受的、无毒的载剂或稀释剂，它们被定义为通常用来配制供动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂时应避免影响该组合的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(ringer’s solutions)、右旋糖溶液、和汉克氏溶液(hank’s solution)。此外，药物组合物或配制品还可以包括其他载剂，佐剂，或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。应当理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于特定应用的施用途径。
[0089]
在一些实施例中，药学上可接受的载剂包含一种或多种盐(如氯化钠、氯化钾、氯化镁)、一种或多种氨基酸(如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或甲硫氨酸)、一种或多种碳水化
合物(如乳糖、麦芽糖、蔗糖)、一种或多种表面活性剂(如聚山梨酯20、聚山梨酯80)、一种或多种螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta)和乙二胺-n,n
′‑
二琥珀酸(edds))、以及一种或多种醇(如乙醇和甲醇)。优选地，药物组合物的ph为5至8，如ph为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、或其间的任何值。
[0090]
在一些实施例中，用于本发明的药物组合物包含浓度为1mm至100mm、25mm至100mm、50mm至100mm、或75mm至100mm的氯化钠、氯化钾和/或氯化镁。例如，氯化钠、氯化钾和/或氯化镁的浓度可以是1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、或其间的任何浓度。
[0091]
在一些实施例中，用于本发明的药物组合物包含浓度为1mm至50mm、5mm至50mm、5mm至30mm、5mm至20mm、或10mm至20mm的组氨酸、精氨酸和/或甘氨酸。例如，组氨酸、精氨酸和/或甘氨酸的浓度可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm、25mm、26mm、27mm、28mm、29mm、30mm、31mm、32mm、33mm、34mm、35mm、36mm、37mm、38mm、39mm、40mm、41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm、或50mm、或其间的任何浓度。
[0092]
在一些实施例中，用于本发明的药物组合物包含浓度为1％至10％容重(w/v)或5％至10％(w/v)的蔗糖、乳糖、和/或麦芽糖。例如，蔗糖、乳糖和/或麦芽糖的浓度可以是1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)、4％(w/v)、4.5％(w/v)、5％(w/v)、5.5％(w/v)、6％(w/v)、6.5％(w/v)、7％(w/v)、7.5％(w/v)、8％(w/v)、8.5％(w/v)、9％(w/v)、9.5％(w/v)、或10％(w/v)、或其间的任何浓度。
[0093]
在一些实施例中，用于本发明的药物组合物包含浓度为0.01％(w/v)至0.1％(w/v)、0.01％(w/v)至0.08％(w/v)、或0.02％(w/v)至0.05％(w/v)的聚山梨酯20(ps20)和/或聚山梨酯80(ps80)。例如，聚山梨酯20和/或聚山梨酯80的浓度可以是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、或0.1％(w/v)、或其间的任何浓度。
[0094]
在一些实施例中，用于本发明的药物组合物包含浓度为0.1mm至5mm、0.1mm至2.5mm、或0.1至1mm的乙二胺四乙酸(edta)和/或乙二胺-n,n
′‑
二琥珀酸(edds)。例如，edta和/或edds的浓度可以是0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、或5mm、或其间的任何浓度。
[0095]
在一些实施例中，用于本发明的药物组合物包含浓度为0.1％至5％容重(w/v)或0.5％至5％(w/v)的乙醇和/或甲醇。例如，乙醇和/或甲醇的浓度可以是0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)、4％(w/v)、4.5％(w/v)、或5％(w/v)、或其间的任何浓度。
[0096]
鉴于本披露，可通过本领域已知的任何方法制备用于本发明的包含腺病毒的药物组合物，该腺病毒包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸分子。例如，包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸分子的腺病毒可以与一种或多种药学上可接受的载剂混合以获得溶液。该溶液可以在范围为-55℃
±
10℃至-85℃
±
10℃的受控温度下作为冷冻液体储存在合适的小瓶中直至施用于受试者。
[0097]
在某些实施例中，根据本发明的药物组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知可进一步提高对所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明药物组合物的rsv f多肽的保护性免疫应答。合适的佐剂的实例包括铝盐，如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，如mf59(参见，例如wo 90/14837)；皂苷配制品，例如像qs21和免疫刺激复合物(iscoms)(参见，例如us 5,057,540；wo 90/03184、wo96/11711、wo 2004/004762、wo 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例是单磷酰脂质a(mpl)、3-o-脱酰基mpl(3dmpl)、含cpg基序的寡核苷酸、adp-核糖基化细菌毒素或其突变体，如大肠杆菌热不稳定肠毒素lt、霍乱毒素ct等；真核蛋白(例如，抗体或其片段(例如针对抗原本身或cd1a、cd3、cd7、cd80)和受体的配体(例如cd40l、gmcsf、gcsf等)，其在与接受者细胞相互作用时刺激免疫应答。在某些实施例中，本发明的药物组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾、或其组合的形式，浓度为0.05-5mg，例如每剂量的铝含量为0.075-1.0mg。
[0098]
根据特定的实施例，包含腺病毒载体的药物组合物与流感疫苗(如季节性流感疫苗)组合使用，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸。优选地，药物组合物和流感疫苗共同施用。
[0099]
如本文所用，在向受试者施用两种或更多种疗法的背景下，术语“组合”是指使用多于一种疗法。术语“组合”的使用并不限制向受试者施用疗法的顺序。例如，可以在向受试者施用第二疗法之前(例如，1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、与其伴随地、或继其之后(例如，1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)施用第一疗法(例如，本文所述的药物组合物)。
[0100]
如本文所用，在向受试者施用两种或更多种疗法的上下文中，术语“共同施用”是指将两种或更多种疗法组合使用，并且在24小时的时段内向受试者施用这两种或更多种疗法。在某些实施例中，将“共同施用”疗法预先混合并同时一起向受试者施用。在其他实施例中，将“共同施用”疗法在24小时内，例如在12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时或更短时间内，以单独的组合物向受试者施用。优选地，将“共同施用”疗法在60分钟内，例如在30分钟、20分钟、10分钟、5分钟或更短时间内，以单独的组合物向受试者施用。将“共同施用”疗法以单独的组合物同时向受试者施用。
[0101]
施用时间可以显著地变化，从每天一次到一年一次，再到十年一次。典型的方案由免疫接种随后是以时间间隔(如1至24周间隔)进行的加强注射组成。另一方案由免疫接种随后是1、2、4、6、8、10和12个月后进行的加强注射组成。另一方案需要终生每两个月注射一次。另一方案需要每年或每2、3、4或5年注射一次。可替代地，加强注射可以是不定期的，如通过监测免疫应答所指示的。
[0102]
本领域技术人员容易理解，可以基于施用后测量的免疫应答来调整用于引发和加强施用的方案。例如，通常在施用引发组合物后数周或数月，例如，在施用引发组合物后约1周、或2-3周或4周、或8周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周、或36周、或40周、或44
周、或48周、或52周、或56周、或60周、或64周、或68周、或72周、或76周、或一至两年施用这些加强组合物。
[0103]
根据特定的方面，可以施用一种或多种加强免疫接种。不管采用多少种加强组合物，各个引发组合物和加强组合物中的抗原都不必相同，但是应该共享抗原决定簇或彼此基本相似。
[0104]
鉴于本披露，本发明的药物组合物可以根据本领域已知的方法配制。
[0105]
药物组合物可以通过用于预防性治疗和/或治疗性治疗的合适方式来施用。非限制性实施例包括胃肠外施用，如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜施用，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射来施用组合物。技术人员已知施用药物组合物以诱导对该药物组合物中的一种或多种抗原的免疫应答的各种可能性。在某些实施例中，肌内施用本发明的组合物。
[0106]
本发明还提供了在有需要的人受试者中为受试者接种针对rsv感染和流感病毒感染两者的疫苗而不诱导严重不良反应的方法。在特定的实施例中，该方法包括向受试者施用：(a)有效量的包含腺病毒载体的药物组合物，优选疫苗，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸；以及(b)有效量的流感疫苗。
[0107]
根据本技术的实施例，药物组合物的有效量包含足以为受试者接种针对rsv感染的疫苗而不诱导严重不良事件的药物组合物的量。在特定的实施例中，有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
10
至约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体，优选地每剂量约1x10
11
个病毒颗粒的腺病毒载体，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸。
[0108]
根据本技术的实施例，有效量的药物组合物包含每剂量约1x10
10
至约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体，例如每剂量约1x10
10
个病毒颗粒、每剂量约2x10
10
个病毒颗粒、每剂量约3x10
10
个病毒颗粒、每剂量约4x10
10
个病毒颗粒、每剂量约5x10
10
个病毒颗粒、每剂量约6x10
10
个病毒颗粒、每剂量约7x10
10
个病毒颗粒、每剂量约8x10
10
个病毒颗粒、每剂量约9x10
10
个病毒颗粒、每剂量约1x10
11
个病毒颗粒、每剂量约2x10
11
个病毒颗粒、每剂量约3x10
11
个病毒颗粒、每剂量约4x10
11
个病毒颗粒、每剂量约5x10
11
个病毒颗粒、每剂量约6x10
11
个病毒颗粒、每剂量约7x10
11
个病毒颗粒、每剂量约8x10
11
个病毒颗粒，每剂量约9x10
11
个病毒颗粒、或每剂量约1x10
12
个病毒颗粒的腺病毒载体，该腺病毒载体包含编码在融合前构象中稳定化的rsv f多肽的核酸。优选地，重组rsv f多肽具有seq id no:4或seq id no:5的氨基酸序列，并且腺病毒载体为血清型26的腺病毒载体，如重组ad26。
[0109]
根据本技术的实施例，流感病毒疫苗的有效量包含足以诱导针对流感病毒的保护性免疫应答而不诱导严重不良事件的流感病毒疫苗的量。在特定的实施例中，有效量的流感病毒疫苗包含单一剂量的可商购的季节性流感病毒疫苗。
[0110]
实例
[0111]
本发明的以下实例是为了进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求确定。
[0112]
实例1：2a期人体研究
[0113]
进行了一项2a期、随机分配、双盲、安慰剂对照的研究，以在60岁及以上健康成人中评估季节性流感疫苗和ad26.rsv.pref(一种无复制能力的ad26，其含有编码rsv a2株系的融合前构象稳定化的f蛋白(pre-f)的dna转基因)在共同施用和不共同施用的情况下的
安全性和免疫原性。
[0114]
研究设计/概述-[0115]
在大约180名年龄≥60岁且健康状况稳定的男性和女性受试者中进行了一项单中心、随机分配、安慰剂对照、双盲的2a期研究，这些受试者以1:1的比率平行随机分配到两组中的一组：
[0116]-组1(共同施用(“coad”))在第1天接受1x10
11
个病毒颗粒(vp)的ad26.rsv.pref，与可商购的季节性流感疫苗(fluarix)同时施用，并在第29天接受安慰剂。
[0117]-组2(对照)在第1天接受安慰剂，与可商购的季节性流感疫苗(fluarix)同时施用，并在第29天接受1x10
11
vp ad26.rsv.pref。
[0118]
所有研究疫苗均肌内给予，并且研究设计和研究组的示意性概述如下表1所示：
[0119]
表1
[0120][0121]
n＝受试者数量
[0122]
疫苗接种时间表/研究持续时间：每名参与者的研究持续时间为约30周，并且研究由以下组成：在第1天和第29天的疫苗接种、每次疫苗接种后28天的随访期、以及第二次疫苗接种后随访至6个月。每次疫苗接种后7天记录诱发的不良事件(ae)。从知情同意书中收集非诱发的ae，直至每次疫苗接种后第28天，并在整个研究期间评估sae。在第1天、第29天和第57天评估免疫应答。
[0123]
主要疗效终点：本研究的主要目的是：(1)使用几何平均滴度(gmt)比率的非劣效性界值2(对照组/共同施用组)，评估ad26.rsv.pref和季节性流感疫苗的伴随施用相对于季节性流感疫苗的单独施用在体液免疫应答方面的非劣效性，该体液免疫应答以施用流感疫苗后28天针对所有四种流感疫苗株系的血凝抑制(hi)抗体的gmt表示；以及(2)评估向年龄≥60岁的受试者肌内单独施用或与季节性流感疫苗伴随施用单一剂量的1x10
11
vp ad26.rsv.pref的安全性和耐受性。
[0124]
统计方法：通过使用方差分析(anova)模型(第28天滴度作为因变量且方案作为协变量)，计算对照组(组2)和coad组(组1)之间四种季节性流感疫苗株系中每一种的对数转换hi抗体滴度差的95％单侧置信上限来评估主要免疫原性目的。使用welch-satterthwaite t区间方法计算置信限，以允许估计每种方案的单独方差。将置信限(通过取幂(exponentiation))反转换为gmt比率，并与非劣效性限值2进行比较。
[0125]
结果-[0126]
共有180名受试者被随机分配并接种疫苗，每组90名受试者。coad组(组1)的两名受试者在接受第二次剂量前中止研究(原因：拒绝进一步的研究治疗(1名受试者)以及因ae(耳部感染)而中止(1名受试者))。此外，还有两名受试者(每组各一名)在接受两次剂量后中止研究(原因：失访)。
[0127]
在所有受试者完成第57天的安全性和免疫原性评估后(即，第二次剂量后28天)进行主要分析。分析中纳入了直至第57天的所有数据。
[0128]
1.主要免疫原性分析：
[0129]
免疫原性分析基于符合方案流感免疫原性(ppii)群体，其定义为经随机分配并接受首次疫苗接种且可获得免疫原性数据的所有受试者，不包括具有预期会影响免疫原性结果的重大方案偏离的受试者。自然流感感染后采集的样品不包括在季节性流感疫苗的免疫原性评估中。
[0130]
对于四种流感株系中的每一种，接种疫苗fluarix后28天的几何平均血凝抑制(hi)抗体滴度(gmt)、对照组(fluarix 安慰剂)与共同施用组(fluarix ad26.rsv.pref)的几何平均比率(gmr)、以及它们相应的ci示出在表2和图1中。所有四个gmr(对照组/coad组)的置信上限均低于非劣效性界值2。因此得出结论，ad26.rsv.pref fluarix共同施用相对于对照组(fluarix 安慰剂)具有非劣效性。
[0131]
表2：接种流感疫苗后28天的hi抗体应答；ppii群体
[0132][0133]
基于welch-satterthwaite t区间法。计算四种流感疫苗株系中每一种的对数转换hi抗体滴度差(对照组减去coad组)和ci，并将其(通过取幂)反转换为gmt比率(对照组/coad组)和相应的ci。
[0134]
#
对数转换hi抗体滴度的最小二乘(ls)平均值，(通过取幂)反转换为gmt。根据单尾t检验(one-tailed t-test)和备择假设(alternative hypothesis)：gmt比率《2来计算p值。
[0135]
一次通过调整上述模型中的基线hi水平以及一次在fa集上运行该模型，进行上述非劣效性分析的敏感性分析。敏感性分析的结果与上述结果一致。
[0136]
图2示出了符合方案流感免疫原性群体的hi抗体应答(hai)随时间推移的平均(95％ci)实际值的图；
[0137]
图3示出了符合方案流感免疫原性群体疫苗接种后28天的hi抗体应答(hai)的血清转化差的森林图。针对四种流感疫苗株系的血清转化率定义为疫苗接种前滴度《1:10的受试者在疫苗接种后滴度≥1:40，或者疫苗接种前滴度≥1:10的受试者在疫苗接种后滴度增加≥4倍。根据wilson评分方法计算组间血清转化的受试者比例差(对照组减去coad组)和90％双侧ci。
[0138]
图4示出了符合方案流感免疫原性群体疫苗接种后28天的hi抗体应答(hai)的血清保护差的森林图。针对四种流感疫苗株系的血清保护率定义为疫苗接种后滴度≥1:40的受试者的百分比。根据wilson评分方法计算组间血清保护的受试者比例差(对照组减去coad组)和90％双侧ci。
[0139]
2.次要免疫原性分析：
[0140]
体液免疫原性分析基于符合方案rsv免疫原性(ppri)群体，其定义为经随机分配并完全进行疫苗接种(所有三次疫苗接种，即，季节性流感、ad26.rsv.pref和安慰剂)且可获得免疫原性数据的所有受试者，不包括具有预期会影响免疫原性结果的重大方案偏离的受试者。自然rsv感染后采集的样品不包括在ad26.rsv.pref的免疫原性评估中。
[0141]
为了评估ad26.rsv.pref与fluarix共同施用对于针对rsv a2的病毒中和抗体(vna a2)水平的影响，计算在ad26.rsv.pref单独给药和共同施用后28天vna a2水平的gmt比率。此比率和相应的90％ci为1.2(1.00；1.45)。接种ad26.rsv.pref后28天的几何平均vna a2滴度(gmt)、对照组(ad26.rsv.pref)与共同施用组(fluarix ad26.rsv.pref)的几何平均比率(gmr)、以及相应的ci示出在表3中。
[0142]
表3：接种ad26.rsv.pref后28天对抗rsv a2株系的中和抗体；ppri群体
[0143][0144]
基于welch-satterthwaite t区间法。计算对数转换hi抗体滴度差(对照组减去coad组)和ci，并将其(通过取幂)反转换为gmt比率(对照组/coad组)和相应的ci。
[0145]
#
对数转换hi抗体滴度的最小二乘(ls)平均值，(通过取幂)反转换为gmt。
[0146]
图5示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的对抗rsv a2株系的中和抗体滴度图。对于fluarix ad26.rsv.pref小组和仅ad26.rsv.pref小组，vna a2的倍数增加的几何平均数和95％ci分别为2.8(2.5；3.2)和3.1(2.7；3.6)。
[0147]
图6示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的如通过elisa测量的由rsv pre-f蛋白引起的抗体应答的图，图中示出了几何平均数及95％ci，并且n＝具有基线数据的受试者数量。对于fluarix ad26.rsv.pref小组和仅ad26.rsv.pref小组，pre-felisa的倍数增加的几何平均数和95％ci分别为2.3(2.1；2.7)和2.6(2.3；3.0)。
[0148]
图7示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的如通过elisa测量的由rsv post-f蛋白引起的抗体应答的图，图中示出了几何平均数及95％ci，并且n＝具有基线数据的受试者数量。对于fluarix ad26.rsv.pref小组和仅ad26.rsv.pref小组，post-f elisa的倍数增加的几何平均数和95％ci分别为2.0(1.8；2.2)和2.1(1.9；2.3)。
[0149]
图8示出了符合方案rsv免疫原性群体随时间推移的如通过ifn-γelispot测定法测量的rsv-f特异性t细胞应答的箱形图。请注意，由于核对/合并问题，省略了两名受试者第29天的elispot样品。
[0150]
3.安全性：
[0151]
安全性分析基于完全分析(fa)群体，该群体定义为经随机分配并接受至少一个剂量的研究疫苗的所有受试者，而不管是否发生方案偏离和疫苗类型。
[0152]
安慰剂给药后，组1(coad)的一名受试者(1.1％)报告3种sae。这些sae为4级高血压急症、4级心动过缓和3级肾损伤。这些ae被认为与疫苗接种无关。未报告其他sae。无致死性结局的ae。
[0153]
组1(coad)的一名受试者(1.1％)在fluarix ad26.rsv.pref施用后经历了导致中止的ae。此ae为2级耳部感染，被认为与疫苗接种无关。
[0154]
最常报告的诱发的局部事件是疼痛/压痛，在伴随或不伴随fluarix给药的ad26.rsv.pref给药后，ad26.rsv.pref小组中分别有78.9％或76.7％的受试者报告了疼痛/压痛。在伴随或不伴随ad26.rsv.pref给药的fluarix给药后，fluarix小组中分别有46.7％和38.9％的受试者报告了疼痛/压痛。在安慰剂小组中，疼痛/压痛的报告低于20％。疼痛/压痛的中位发病时间为1天，与或不与fluarix共同施用时ad26.rsv.pref小组中的中位持续时间为2天或4天，并且安慰剂小组或fluarix小组中的中位持续时间为1天或2天。
[0155]
在ad26.rsv.pref给药(与或不与fluarix共同施用)后，超过30％的受试者报告的诱发的全身性ae为关节痛、寒战、疲劳、头痛和肌痛。在施用单独的fluarix或安慰剂后，低于20％的受试者报告了这些ae。在接种ad26.rsv.pref(有或没有fluarix)的这些组中，中位发病时间典型地为1至2天，并且中位持续时间一般为1至2天。
[0156]
给药后超过5％的受试者报告的非诱发的ae为呼吸道感染和血压升高。在fluarix 安慰剂给药后，12.2％的受试者报告了呼吸道感染，在fluarix ad26.rsv.pref共同施用后，11.1％的受试者报告了呼吸道感染，在仅ad26.rsv.pref给药后，5.6％的受试者报告了呼吸道感染，并且在安慰剂给药后，8.0％的受试者报告了呼吸道感染。
[0157]
本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的广泛发明构思的情况下，可以对上述实施例进行改变。因此，应当理解的是，本发明不限于所披露的具体实施例，但是旨在涵盖如所附权利要求书限定的处于本发明精神和范围之内的修改。
[0158]
序列
[0159]
seq id no:1(rsv f蛋白a2全长序列)
[0160][0161]
seq id no:2(三聚化结构域)
[0162][0163]
seq id no:3(接头)
[0164][0165]
seq id no:4(rsv pref2.1)
[0166][0167]
seq id no:5(rsv pref2.2)
[0168][0169]
seq id no:6(rsv f pre-f2.1)
[0170][0171][0172]
seq id no:7(rsv f pre-f2.2)
[0173][0174]