小檗胺在抗结核分枝杆菌药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种小檗胺在抗结核分枝杆菌药物中的应用。


背景技术：

2.至今结核病仍然是全球感染性疾病的第一“杀手”，主要原因是卡介苗不能有效地预防成人肺结核，结核菌耐药问题越来越严重，艾滋病、移民和贫困等社会问题使得结核病在一些发达国家开始回升。世界卫生组织(who)报告全球现有结核病人2000万，每年新增结核病人800—1000万，每年200—300万人死于结核病。我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查结果表明，我国有5.5亿人感染了结核菌，现有肺结核病人451万，每年死亡人数约13万，位于全国各种传染病之首。耐药结核病人多，结核分枝杆菌总耐药率为27.8％，其中初始耐药率为18.6％，获得性耐药率为46.5％，耐多药率为10.7％。
3.结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性传染病，合理、规律的化疗一般在1～2个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗3～4个月，甚至更长时间。由于耐多药结核病的流行、化疗药物的毒副作用，以及人类免疫缺陷病毒的感染、免疫抑制剂的使用和老年性结核病等原因引起的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战，尤其是耐多药结核病(mdr—tb)、广泛耐药结核病(xdr-tb)面临无药可治的困难局面，使我国的结核病疫情的控制并不十分理想，结核病人数、发病人数、死亡人数均位于全国各种传染病之首。因此，研制新的抗结核制剂势在必行。
4.结核特别是耐药结核是当前结核治疗的重点和难点，宿主定向治疗是当今耐药结核病研究领域的热点，其核心理念是通过干预宿主基因功能来增强保护性免疫应答或抑制过度炎症反应来治疗耐药结核病。在深入认识宿主抗结核免疫特征和调节机制的基础上，研发免疫治疗或更广义的基于宿主基因定向治疗结核病新策略为结核病治疗，尤其是克服耐多药结核提供了新的愿景。


技术实现要素：

5.针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种小檗胺在抗结核分枝杆菌药物中的应用，通过增强巨噬细胞的吞噬作用，使得巨噬细胞对结核分枝杆菌进行快速清除，同时降低分枝杆菌的活性，影响分枝杆菌的增殖。
6.为实现上述目的，本发明提供一种小檗胺在抗结核分枝杆菌药物中的应用，小檗胺作为抗结核药物单独制备或与其他药学上可接受的药物联合制备抗结核药物。
7.作为优选，所述结核病是由结核分枝杆菌毒株h37rv引起的。
8.作为优选，小檗胺的分子式为c37h40n2o6,结构式为：
[0009][0010]
作为优选，所述小檗胺在制备抗结核药物中增强巨噬细胞对结核分枝菌的清除作用药物中的应用。
[0011]
作为优选，所述小檗胺在制备抑制分枝杆菌增殖的药物中的应用；
[0012]
本发明的有益效果是：本技术采用作为上市药物的小檗胺作为抗结核分枝杆菌的治疗药物；小檗胺作为上市药物，属于叔胺碱，呈弱碱性肠道吸收好，具有安全性高，毒副作用低的优点，且已形成良好的稳定剂型，本技术通过多次试验确定了小檗胺对巨噬细胞增强作用和对结核分枝杆菌的抑制作用，从而为开发高效、低毒的靶向宿主的抗结核药物提供了新的方向。
附图说明
[0013]
图1为本发明的小檗胺的剂量反应曲线；
[0014]
图2为本发明的小檗胺对荧光结核分枝杆菌bcg-gfp的抑制情况；
[0015]
图3为本发明的小檗胺对结核分枝杆菌h37rv的抑制情况。
具体实施方式
[0016]
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0017]
小檗胺(bbm)是从中药中提取中的一种天然双苄基异喹啉生物碱，作用广泛，不良反应小，长期毒性低，目前临床主要将其作为升白细胞药用于抗肿瘤放疗或化疗导致的白细胞下降，在化疗开始时使用可延迟白细胞下降的时间。此外，小檗胺还可以抑制小鼠皮肤移至导致的排斥反应和迟发型超敏反应；通过对钙离子通道的拮抗作用治疗心率失常；通过多种途径抑制肿瘤细胞的增殖，发挥抗肿瘤活性。因此现有技术中都是利用小檗胺对于抗肿瘤药物的应用。
[0018]
本发明的技术方案主要为小檗胺在抗结核分枝杆菌药物中的应用，本发明测定了结核分枝杆菌强毒株h37rv感染巨噬细胞后，小檗胺在细胞内的抗结核分枝杆菌活性，结果显示小檗胺具有明显的抗结核分枝杆菌活性，显著增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除：
[0019]
包括以下步骤：
[0020]
实施例一：
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1)巨噬细胞的分化：选自中国科学院细胞库中的thp-1细胞，用含有10％胎牛血清的1640培养基进行培养，放置在温度为37℃；5％co2的细胞培养箱中培养一段时间后，采用96孔板按照每孔5*104个细胞数进行铺板，然后加入终浓度为10ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯(pma)刺激过夜，使其分化为巨噬细胞，培养24小时后更换为完全培养基。
[0022]
2)细胞存活率的测定：将上述诱导分化的巨噬细胞继续培养24小时后加入小檗胺，小檗胺的浓度分别为1μm、10μm、20μm、40μm、60μm、80μm、100μm、120μm，每个浓度分别做三个重复，同时利用dmso(二甲基亚砜)作为对照试验，在37℃，5％co2继续培养48h，利用cck-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐)试剂盒检测细胞活性。更为具体的是，每个孔内加入10ul cck-8,只加入cck-8和培养基的孔作为背景孔，培养箱培养1小时后，利用酶标仪器测定od450nm的吸光度。
[0023]
3)细胞存活率的计算：
[0024]
细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]x100％；
[0025]
其中as为实验孔(含有细胞的培养基、cck-8、不同浓度的小檗胺)；ac：对照孔(含有细胞的培养基、cck-8、dmso)；ab：空白孔(不含细胞的培养基、cck-8)。
[0026]
计算出不同浓度下小檗胺的细胞存活率后，利用相关软件绘制剂量反应曲线并计算ic
50
(半抑制浓度)
[0027]
图1为小檗胺的剂量反应曲线，结果表明，小檗胺对thp-1细胞的ic
50
浓度为43.66um。
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实施例二：
[0029]
1)结核分枝杆菌的感染：thp-1细胞以24孔板每孔2*105个细胞数的数量诱导成巨噬细胞，感染前24小时加入小檗胺进行预处理，荧光结核分枝杆菌bcg-gfp按10的感染复数对细胞进行感染，4小时后用pbs(磷酸缓冲液)进行清洗3遍，加入1640完全培养基中，在在37℃，5％co2的培养箱中继续培养，在此过程中一直维持小檗胺的添加。
[0030]
2)流式细胞术检测小檗胺抗结核分枝杆菌活性：分别在感染4小时和48小时后收取细胞，利用pbs清洗两遍，加入胰酶消化约3分钟左右，然后加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞后收集到流式管中，2000rpm离心5分钟，200ulpbs重悬细胞后用流式细胞仪上机检测。
[0031]
图2为小檗胺对荧光结核分枝杆菌bcg-gfp的抑制情况，结果表明，在感染后4h时，小檗胺并未表现出明显的抑制效果，说明小檗胺不影响巨噬细胞对结核分枝杆菌的吞噬，在48h时，15μm和25μm的小檗胺均能明显抑制结核分枝杆菌的增殖，更进一步研究表明25μm的小檗胺有轻微的细胞毒性。
[0032]
实施例三：
[0033]
1)结核分枝杆菌的感染：thp-1细胞以24孔板每孔2*105个细胞数的数量诱导成巨噬细胞，感染前24小时加入小檗胺进行预处理，结核分枝杆菌标准株h37rv按10的感染复数对细胞进行感染，4小时后用pbs(磷酸缓冲液)进行清洗3遍，加入1640完全培养基中，在在37℃，5％co2的培养箱中继续培养，在此过程中一直维持小檗胺的添加。
[0034]
2)涂板计数cfu：感染48小时后，向细胞中加入终浓度为0.1％的sds裂解液来对细胞进行裂解，分别按102、103、104的稀释倍数涂板，37℃细菌培养箱培养21天后，计数cfu。
[0035]
图3为小檗胺对结核分枝杆菌h37rv的抑制情况，结果表明，5μm、10μm、15μm、20μm的小檗胺均能抑制巨噬细胞内结核分枝杆菌的生长，和dmso对照组相比，加入小檗胺后结核分枝杆菌的存活率有明显下降，而且在这个浓度下没有明显的细胞毒性，可用于开发高效、低毒的靶向宿主的抗结核药物。
[0036]
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领
域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。