眼科液体敷料及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及药物制剂技术领域，尤其是涉及一种眼科液体敷料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着生产生活方式的转变，电脑、手机的应用日益增多，长时间的使用视频终端会导致“视频终端综合征”。目前该类患者众多，其眼部症状表现为眼干、眼痒、眼胀痛、烧灼异物感及视疲劳等。泪液不足、眼表组织的损伤和眼表免疫平衡的破坏是该病最主要的原因。
3.现有的眼科外用药物多采用人工合成的化学药物作为有效成分，使用时易产生不良反应，安全性欠佳。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种眼科液体敷料，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
6.本发明的目的之二在于提供上述眼科液体敷料的制备方法。
7.本发明的目的之三在于提供上述眼科液体敷料的应用。
8.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种眼科液体敷料，包括细胞外囊泡和基质。
9.进一步的，所述基质包括羧甲基纤维素、透明质酸或羟丙甲纤维素中的一种或多种。
10.进一步的，所述细胞外囊泡包括msc细胞来源或treg细胞来源。
11.进一步的，所述眼科液体敷料的ph为6.5~7.0。
12.进一步的，所述眼科液体敷料的渗透压为0.24~0.36 osmol/kg。
13.进一步的，按照重量百分比计算，所述细胞外囊泡占眼科液体敷料的1%~5%。
14.进一步的，按照重量百分比计算，所述细胞外囊泡占眼科液体敷料的1%。
15.本发明还提供了上述的眼科液体敷料的制备方法，将细胞外囊泡与基质混合均匀，得到所述眼科液体敷料；优选地，将配方量的细胞外囊泡加入基质中，在转速18~22rpm，温度4℃的条件下混合0.4~0.6小时。
16.进一步的，所述细胞外囊泡来源于msc细胞，制备方法包括：去除msc细胞培养基上清的杂质后，以80000~120000g离心100~140min，收集沉淀，得到msc细胞的细胞外囊泡。
17.此外，本发明还提供了上述的眼科液体敷料在制备缓解视频终端综合征的产品中的应用。
18.进一步的，所述视频终端综合征包括眼部不适；
优选地，所述眼部不适包括眼干、眼痒、眼胀痛、烧灼异物感及视疲劳中的一种或多种。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的眼科液体敷料，至少由细胞外囊泡和基质复配而成，具有滋润眼表、修复眼表组织、调节眼表免疫环境的功能。通过滴眼的方式使用本发明提供的眼用辅料后，能够有效发挥滋润眼表的功能，同时，其中的细胞外囊泡还能够起到修复眼表组织、调节眼表免疫环境等作用，从而高效缓解“视频终端综合征”。此外，本发明提供的眼用辅料还具有较高的安全性。
20.经临床试验发现，本发明提供的眼科液体敷料能够有效缓解视频终端综合征，填补了目前细胞外囊泡相关眼科液体敷料的空白。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明实施例1提供的msc细胞光学显微镜图；图2为本发明实施例1提供的msc细胞鉴定流式图；图3为本发明实施例1提供的msc细胞外囊泡的透射电子显微镜(tem)图；图4为本发明实验例1提供的动物实验中干眼模型小鼠钴蓝光眼前节相。
具体实施方式
23.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
24.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
25.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.根据本发明的一个方面，提供了一种眼科液体敷料，包括细胞外囊泡和基质。
27.其中，细胞外囊泡是细胞分泌的纳米级囊泡，具备母细胞的功能，例如：间充质干
细胞（msc）来源的细胞外囊泡具备修复功能，调节性t细胞（treg）来源的细胞外囊泡具备免疫调节功能。与人工合成的药物相比，细胞外囊泡具有天然、安全性好的特点。本发明对细胞外囊泡的来源不作限定，凡是具有治疗作用的细胞外囊泡均可作为本发明眼用辅料所使用的细胞外囊泡。
28.基质为眼用辅料的主要组成成分，本发明对基质的具体选择不做限定，凡是具有滋润眼表功能的药物均可。
29.本发明提供的眼科液体敷料，通过细胞外囊泡和基质的配合使用，具有滋润眼表、修复眼表组织、调节眼表免疫环境的功能，能够高效缓解“视频终端综合征”。此外，由于本发明提供的眼用辅料使用生物材料细胞外囊泡作为有效成分，极大程度地避免了不良反应的发生，具有较高的安全性。
30.在一些优选的实施方式中，所述基质包括羧甲基纤维素、透明质酸或羟丙甲纤维素中的一种或多种。
31.可以理解的是，“一种或多种”指的是基质可以单独为羧甲基纤维素，或者单独为透明质酸，或者单独为羟丙甲纤维素，也可以为羧甲基纤维素和透明质酸的组合，或者为透明质酸和羟丙甲纤维素的组合，或者为羧甲基纤维素和羟丙甲纤维素的组合，或者同时包含甲基纤维素钠、透明质酸和羟丙甲纤维素。
32.在另一些优选的实施方式中，所述细胞外囊泡包括msc细胞来源和/或treg细胞来源。
33.可以理解的是，“和/或”指的是细胞外囊泡可以单独为msc细胞来源，或者单独为treg细胞来源，或者为msc细胞来源和treg细胞来源的混合物。
34.为了更好地发挥细胞外囊泡的活性作用，优选调整眼用辅料的ph为6.5~7.0，例如可以为，但不限于6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。
35.此外，为了相同的目的，还可以同时或独立地调整眼用辅料的渗透压为0.24~0.36 osmol/kg，例如可以为，但不限于0.24 osmol/kg、0.26 osmol/kg、0.28 osmol/kg、0.30 osmol/kg、0.32 osmol/kg、0.34 osmol/kg或0.36 osmol/kg。
36.在本发明提供的眼用辅料中，按照重量百分比计算，当细胞外囊泡的含量占眼科液体敷料的1%~5%时，便可发挥良好的修复眼表组织、调节眼表免疫环境等作用。因此，当优选1%的细胞外囊泡添加量时，可以进一步在保证效果的基础上有效节约成本。
37.本发明还提供了上述眼用辅料的制备方法，将细胞外囊泡与基质混合均匀即可得到眼用辅料，工艺简单，操作方便，对技术人员的专业性要求较低，适于产业上推广应用。
38.优选地，将配方量的细胞外囊泡加入基质中，在转速18~22rpm，例如可以为，但不限于18rpm、19rpm、20rpm、21rpm或22rpm，温度4℃的条件下混合0.4~0.6小时，例如可以为，但不限于0.4小时、0.5小时或0.6小时。
39.其中，当所使用的细胞外囊泡来源于msc细胞时，其制备方法包括：去除msc细胞培养基上清的杂质后，以80000~120000g离心100~140min，收集沉淀，得到msc细胞的细胞外囊泡。
40.其中，离心的转速例如可以为，但不限于80000 g、90000 g、100000 g、110000 g或120000 g；离心的时间例如可以为，但不限于100 min、110 min、120 min、130 min或140 min。
41.典型地，可以通过固液分离的方式，例如离心，去除msc细胞培养基上清中的杂质。优选采用两步或多步离心的方式去除杂质。例如，以300 g离心15 min以除去较大杂质，然后以10000g离心15min以去除细胞碎片等。
42.基于本发明提供的眼用辅料的有益效果，本发明还提供了上述眼用辅料在制备缓解视频终端综合征的产品中的应用。
43.其中，“视频终端综合征”包括眼部不适，具体地，包括眼干、眼痒、眼胀痛、烧灼异物感及视疲劳中的一种或多种。
44.下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
45.实施例1本实施例提供了一种眼科液体敷料，包括msc细胞来源的细胞外囊泡和羧甲基纤维素，按照重量百分比计算，所述细胞外囊泡占眼科液体敷料的1%。
46.该眼用辅料的制备方法包括如下步骤：（1）原代msc细胞的提取和鉴定：所述msc细胞采用人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，huc-msc)，其提取过程均在消毒后的超净台中进行，且过程中所需器具和耗材等均为无菌，在制备过程中还需对细胞等采集物以及操作具体过程进行详细标注；同时还可以对细胞进行冻存和复苏，以上操作均属于现有技术，此处不再一一赘述。获得的huc-msc在光学显微镜下贴壁生长呈梭形（图1），并使用流式细胞仪分析sca-1、cd44、cd29、cd117和cd31的表达情况进行细胞鉴定（图2）。
47.（2）原代msc细胞外囊泡的富集：取10代以内的msc细胞培养基上清，以300g离心15 min以除去杂质；然后以10,000g离心15min以去除细胞碎片；以100,000g离心120min，弃上清，收集沉淀，然后重悬于pbs中，得到msc细胞外囊泡溶液，全程无菌操作。随后用tem观察其形貌，结果显示：细胞外囊泡呈杯托状，粒径约为120nm（图3）。还可以对细胞外囊泡溶液进行冻干，以便长期保存。
48.（3）羧甲基纤维素处理细胞外囊泡：将上述步骤得到的细胞外囊泡溶液与羧甲基纤维素均匀混合，利用ph调节剂和渗透压调节剂调整其ph为6.5，渗透压为0.36 osmol/kg。
49.实施例2本实施例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，使用透明质酸作为基质。
50.透明质酸处理细胞外囊泡的步骤包括：将实施例1中得到的细胞外囊泡溶液与透明质酸均匀混合，得到细胞外囊泡含量为1%的产品。利用ph调节剂和渗透压调节剂调整其ph为6.5，渗透压为0.36osmol/kg。
51.实施例3本实施例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，使用羟丙甲纤维素作为基质。
52.羟丙甲纤维素处理细胞外囊泡的步骤包括：将实施例1中得到的细胞外囊泡溶液与羟丙甲纤维素均匀混合，得到细胞外囊泡
含量为1%的产品。利用ph调节剂和渗透压调节剂调整其ph为6.5，渗透压为0.36osmol/kg。
53.实施例4本实施例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，按照重量百分比计算，所述细胞外囊泡占眼科液体敷料的5%。
54.实施例5本实施例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，所述细胞外囊泡为treg细胞来源。
55.treg细胞制备方法如下：（1）通过肘静脉穿刺采血，淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞后，使用miltenyi naive cd4 t细胞磁珠分选试剂盒分选出naive cd4 t细胞。
56.（2）将分选出的naive cd4 t细胞置于事先包被10 μg/ml anti-cd3的培养瓶，并加入配制好的无外泌体培养基（10%无外泌体胎牛血清 1%青链霉素 anti-cd28抗体（2μg/ml） tgf-β（5 ng/ml） il2（20 ng/ml） x-vivo培养基），于37℃，co2体积分数为5％的恒温培养箱中培养，2-3天根据扩增情况1:2或1:3传代。刺激5天后，流式细胞仪鉴定foxp3 cd4 cd25 treg细胞纯度约为70%。
57.（3）取treg细胞培养基上清，以300g离心15 min以除去杂质；然后以10,000g离心15min以去除细胞碎片；以100,000g离心120min，弃上清，收集沉淀，然后重悬于pbs中，得到treg细胞外囊泡溶液，全程无菌操作。还可以对细胞外囊泡溶液进行冻干，以便长期保存。
58.实施例6本实施例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，细胞外囊泡溶液与羧甲基纤维素均匀混合，利用ph调节剂和渗透压调节剂调整其ph为7.0，渗透压为0.24 osmol/kg。
59.实施例7本实施例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，原代msc细胞外囊泡的富集包括：取10代以内的msc细胞培养基上清，以300g离心15 min以除去杂质；然后以10,000g离心15min以去除细胞碎片；以80,000g离心100min，弃上清，收集沉淀，然后重悬于pbs中，得到msc细胞外囊泡溶液，全程无菌操作。
60.对比例1本对比例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，使用msc细胞来源的外泌体替细胞外囊泡。
61.对比例2本对比例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，使用msc细胞来源的红细胞小体代替细胞外囊泡。
62.其中，红细胞小体提取步骤包括：（1）取血，抗凝，3000 rpm，4℃离心10 min，弃去上层血清，加入冰浴的生理盐水重复离心2-3次至完全弃去上层血清；（2）向离心得到的红细胞中加入冰浴的1/4渗透压的低渗生理盐水，冰浴1 h；（3）冰浴后的红细胞9000 rpm，4℃离心10 min，保留沉淀部分，并向沉淀中加入冰
浴的1/4渗透压的低渗生理盐水，冰浴10 min；（4）重复步骤（4）直至离心后上层液体澄清透明。
63.（5）获取的微米大小的红细胞囊泡分别挤压通过孔膜400 nm、200 nm的滤膜，获取平均粒径约140nm的红细胞小体。
64.对比例3本对比例提供了一种眼科液体敷料，与实施例1的不同之处在于，使用维生素a（配制浓度为1000iu/g）代替细胞外囊泡。
65.实验例1 动物实验
①
构建小鼠干眼模型：0.2%苯扎氯铵溶液，每天2次，每眼5ul，连续滴眼7天。
66.②
治疗效果验证：分为pbs组，本发明实施例1-7组及对比例1-3组，给予相应的治疗。滴眼3次/天，7天后使用钴蓝光眼前节照相评估疗效。结果如表1和图4所示：msc细胞外囊泡组泪液分泌量增加和角膜着染几乎消失，指示干眼症状明显减轻。
67.表1 干眼评估试验组别泪膜平均破裂时间（s）酚红棉线平均长度（mm）实施例15.57.12实施例25.27.41实施例34.77.23实施例45.07.92实施例54.46.71实施例64.67.03实施例74.46.82对比例11.54.46对比例21.12.54对比例31.23.79实验例2（1）某科研院所研究人员12人，每天使用电脑6h以上，有眼干、异物感和视疲劳等表现，给予本发明实施例1提供的眼科液体敷料点眼1-2滴，闭目休息5min后，自觉眼部不适症状明显缓解，效果较单独使用羧甲基纤维素好，并且症状缓解持续时间长。使用后无副作用出现。
68.（2）某科研院所研究人员12人，每天使用电脑6h以上，有眼干、异物感和视疲劳等表现，给予本发明实施例2提供的眼科液体敷料点眼1-2滴，闭目休息5min后，自觉眼部不适症状明显缓解，效果较单独使用透明质酸好，并且症状缓解持续时间长。使用后无副作用出现。
69.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。