一种甘草酸酐和金耳多糖降解产物复方组合物及其用途的制作方法

aurantialba，food technology and biotechnology，volume 45,issue 1.2007.pp 45
‑
50)。
6.但本发明在研究过程中发现还没有人研究过甘草酸酐和金耳多糖降解产物保湿作用的协同效应。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种甘草酸酐和金耳多糖降解产物复方组合物；该复方组合物的活性成分是由甘草酸酐和金耳多糖降解产物组成。
8.本发明的另一目的在于提供一种上述复方组合物的在制备保湿化妆品中的应用；药理试验证明该复方组合物具有协同保湿的作用。
9.一种甘草酸酐和金耳多糖降解产物复方组合物，该复方组合物的活性成分是甘草酸酐和金耳多糖降解产物组成；所述甘草酸酐和金耳多糖降解产物的重量比为1:1
‑
1:10。
10.优选的，所述金耳多糖降解产物为金耳子经水酶法提取，酸降解产物。
11.更加优选的，所述的金耳多糖降解产物经苯酚
‑
硫酸法测得总糖量为68.58％。
12.更加优选的，所述水酶法提取中酶为果胶酶，且果胶酶与金耳子粉末得重量比为1：10。
13.该复方组合物还含有制备化妆品时可添加的乳化剂、增稠剂、防腐剂、抑菌剂、保湿剂、渗透剂和美白剂中的一种或多种。
14.优选的，所述甘草酸酐和金耳多糖降解产物的重量比为1:5
‑
1:8。
15.上述甘草酸酐和金耳多糖降解产物复方组合物在制备保湿化妆品中的应用。
16.优选的，所述的甘草酸酐和金耳多糖降解产物复方组合物用量为0.1％
‑
3％。上述复方组合物添加入化妆品中，按照常规制备工艺制备得到保湿化妆品。
17.本发明的有益效果在于，与现有技术相比：本发明人在甘草酸苷(gams)和金耳多糖降解产物(tap)配伍药理活性的研究中发现，金耳子经过水酶提取，酸降解后，多糖的分子量降低，有利于多糖的吸收，将gams和tap组合给药，特别是当两者的重量比为1：1
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1：10配伍时具有很好的保湿协同作用；发明人通过体外保湿活性的测定，样品对干燥损伤的hacat细胞的保护作用，样品对干燥损伤的hacat细胞中aqp3含量影响，均表明该保湿组合物在分子水平上具有提高细胞自身抗干燥能力，增强皮肤的保湿作用，同时，对hacat细胞没有毒副作用。通过将该保湿组合物添加入化妆品种，经健康人群不同时间的皮肤水合度，不同时间的经表皮失水率的测定，证明该保湿膏霜具有良好的保湿效果。
附图说明
18.图1不同时间的皮肤水合度
19.图2不同时间的经表皮失水率
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实验1：金耳多糖及其降解产物的制备
22.取金耳子实体(中国科学院西双版纳热带植物园提供)洗净烘干，粉碎机粉碎，称取上述干粉30g，加入10倍水，加入果胶酶(购自fluka公司)3g，35℃酶解2h，再加入20倍水，沸水浸，2小时，离心(7000r/min,10min)，取上清液，加无水乙醇浓度至80％，4℃醇沉24h，离心(3000r/min,10min),取沉淀，烘干得金耳多糖。将该金耳多糖配制成溶液，经hplc分析其分子量约为12000kd。
23.取金耳多糖0.6g按1：30的比例加入0.5mol/l hcl，搅拌均匀，在80℃，磁力搅拌反应降解4h，6000r/min离心10min，于65℃烘箱中烘干研碎备用。将该金耳多糖降解产物配制成溶液，经hplc分析其分子量约为67kd。
24.实验2：多糖含量的测定
25.采用苯酚
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硫酸法，以葡萄糖为标准品。
26.标准曲线的制作：将葡萄糖标准品在105℃条件下干燥至恒重，取20mg，用超纯水配制成溶液，在容量瓶中定容至100ml，即得到葡萄糖标准品溶液。将标准品溶液用超纯水进行稀释，得到浓度为30、50、100、150、200μg/ml的一组溶液。吸取1.0ml葡萄糖溶液，依次置于5支试管内，然后分别加入5％的苯酚0.5ml和浓硫酸2.5ml，轻摇混匀，25℃放置20min后，于分光光度计490nm处测定吸光度值。以葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。降解前后金耳多糖中糖含量的测定方法与标准品相同，将干燥恒重后的多糖配制成溶液，按照以上方法操作，于490nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量。经苯酚
‑
硫酸法测得金耳多糖的总糖含量约为54.38％，金耳多糖降解产物的总糖量为68.58％。
27.实验3：体外保湿活性
28.采用称重法检测体外保湿活性，将饱和的k2co3溶液和饱和的(nh4)so4溶液放在密封的干燥器中，再将干燥器放在温度为20℃的人工气候箱中，使干燥器的相对湿度(rh)为43％，剔除新鲜猪皮的脂肪层，用镊子去毛，清洗干净于
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20℃冷藏备用。使用时将冷藏猪皮置于ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液(pbs)中解冻30min。取表面平整无伤的猪皮剪成边长约为1.3cm的正方形，然后吸取配好的待测溶液10μl于猪皮表面，立即置于干燥器中，24h后称量猪皮加样品的质量。实验中未涂抹样品的猪皮作为空白对照组，仅涂抹甘草酸苷(gams)为对比例1，仅涂抹金耳降解多糖(tap)为对比例2，仅涂抹甘油为对比例3。每个样品平行测量3次，取平均值，保湿率的计算公式如下。
[0029][0030]
式中：h
n
——一段时间后猪皮和样品的质量，g；
[0031]
h0——未涂抹样品时猪皮和样品的质量，g。
[0032]
表1：不同浓度配比样品的体外保湿性
[0033][0034]
本发明所述的保湿组合物在各种应用中所用量为0.1％
‑
3％。由表1可知，与对比例未涂抹样品的猪皮保湿率相比，该保湿组合物在重量比为1:10的范围内均具有保湿效果，其中1:8时效果最佳；与常用保湿剂甘油相比，该保湿组合物在重量比为1:3时，用量为0.5％时，基本与甘油保湿效果相当。
[0035]
实验4：不同浓度样品样品对hacat细胞毒性影响
[0036]
cell counting kit
‑
8(cck
‑
8)是测定活细胞数量的一种灵敏度高、无放射性且对细胞毒性较低的比色法。活细胞内脱氢酶是持续产生的，cck
‑
8试剂中的wst
‑
8在methoxy pms电子载体存在的情况下，被脱氢酶氧化还原生成橙黄色的甲臜，甲臜染料能溶解在培养基中，且甲臜量与活细胞数量成正比。即活细胞数量越多，o.d值越高。因为样品需接触皮肤以发挥保湿功效，为确保样品的安全性，采用cck
‑
8法评估不同质量浓度样品处理的hacat细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的活力。测定方法：
[0037]
取10
‑
30代处于对数生长期的hacat细胞用dmem培养基将hacat细胞稀释成1
×
105个/孔的浓度细胞悬液，每孔100μl，接种于96孔板中，培养于5％co2、37℃、饱和湿度的孵育箱中培养24h，待细胞融合度达80％时，移去孔中培养液。每孔加入100μl用dmem培养基配制的不同质量浓度的样品溶液，培养24h，移去孔中培养液，用pbs冲洗2次，每孔加入100μl 10％cck
‑
8溶液,于培养箱中避光孵育1h。孵育结束后，立即用酶标仪测定450nm处的od值。每组设置3个复孔取平均值，实验重复操作3遍。
[0038][0039]
实验中以含dmem培养基和cck
‑
8溶液的孔为对照组，以仅含cck
‑
8溶液的孔为空白组。
[0040]
表2：不同浓度样品样品对hacat细胞毒性影响
[0041][0042]
由表2可知，该保湿组合物在用量为0.1％
‑
3％的范围内，对hacat细胞均没有毒副作用，细胞存活率大于100％，且当该保湿组合物用量为2.0％，gams/tap＝1：8时hacat细胞的存活率最大，为120.21％。
[0043]
实验5：样品对干燥损伤的hacat细胞的保护作用
[0044]
建立细胞干燥损伤模型，在细胞水平上探究物质的保湿活性。采用cck
‑
8法评估不同质量浓度样品处理的干燥损伤的hacat细胞的活力。细胞干燥损伤模型的建立方法：取10
‑
30代处于对数生长期的hacat细胞用dmem培养基将hacat细胞稀释成1
×
105个/孔的浓度细胞悬液，每孔100μl，接种于96孔板中，培养于5％co2、37℃、饱和湿度的孵育箱中培养24h，待细胞融合度达80％时进行干燥处理。干燥处理的方法为：将96孔板置于洁净工作台内，保持室温，干燥风速设置为0.4m/s；依次移去孔中所有培养液，在洁净工作台内放20min，hacat细胞干燥损伤实验表明，细胞干燥时间越长，细胞体积越小，活力越低。细胞干燥处理20min，细胞的存活率为50.45％，接近细胞半数致死率。然后加入100μl用dmem培养基配制的待测样品培养24h，样品浓度为对细胞无毒性或对细胞有增殖作用的系列浓度。实验中以仅加入dmem培养基的孔为阴性对照组，阳性对照组为商品级神经酰胺cer
‑
3和金耳多糖降解产物(tap)。测定方法与实验4相同。
[0045]
表3：不同浓度样品对干燥损伤的hacat细胞的保护作用
[0046][0047][0048]
由表3可知，该保湿组合物在用量为0.1％
‑
3％的范围内，对hacat细胞进行先干燥后加样的损伤处理，在实验浓度范围内该保湿组合物均具有损伤修复作用，与实验4相比，实验5同样是该保湿组合物用量为2.0％，gams/tap＝1：8时hacat细胞的存活率最大，为
102.01％，因此，对细胞的损伤修复作用与细胞增殖作用密切相关，样品对细胞的增殖作用越显著，修复损伤细胞的能力越强,且其对干燥损伤的hacat细胞的保护作用明显强于商品级神经酰胺cer
‑
3。
[0049]
实验6：样品对干燥损伤的hacat细胞中aqp3含量影响
[0050]
取10
‑
30代处于对数生长期的hacat细胞用dmem培养基将hacat细胞稀释成1
×
105个/孔的浓度细胞悬液接种于6孔板中，按实验5的方法培养24h后进行细胞干燥损伤处理，用dmem培养基配制无细胞毒性或者具有细胞增殖作用的系列样品浓度，样品组加入不同浓度的待测样品，对照组加入dmem培养基和商品级神经酰胺cer
‑
3，每孔2ml。继续培养24h后移出孔中培养基，每孔加入2mlpbs缓冲液冲洗，再将6孔板放在冰上，每孔加入1mlpbs和200μl中速ripa裂解液，充分裂解后，将细胞裂解液移至1.5ml离心管中。用超声波细胞粉碎机进一步破碎细胞，时间为1min，于1000g离心3min，将上清液保存在2ml离心管中备用。
[0051]
酶联免疫吸附实验(elisa)试剂盒是利用双抗体夹心法测定标本中aqp3含量，所选用的抗体为人水通道蛋白3,具有良好的稳定性和板间准确性，将人水通道蛋白3(aqp3)elisa试剂盒(北纳创联生物技术有限公司)中的标准品稀释成2000、1000、500、250、125ng/l的标准溶液，按说明书步骤操作，测定细胞裂解液在450nm处的吸光值。
[0052]
表4：样品对干燥损伤的hacat细胞中aqp3含量影响
[0053][0054]
由表4可知，elisa试剂盒测定样品对细胞内aqp3含量的实验表明，实施例1
‑
7均能上调干燥损伤的hacat细胞中aqp3水平，当该保湿组合物用量为2.0％，gams/tap＝1：8时比对比例1商品级神经酰胺cer
‑
3还上调了27.48％，因此，上述实验在分子水平上均能证明该保湿组合物具有提高细胞自身抗干燥能力，增强皮肤的保湿作用。
[0055]
实验7：组合物按照以下配方制成保湿霜，处方如下：
[0056][0057]
制备工艺：把水相除保湿组合物外，加入水相锅加热至85℃溶解，待用，再把油相加入油相锅加热至80℃溶解待用，乳化锅预热至85℃，先加入水相，再加入油相，均质乳化(3200r/min)5min，后搅拌(25r/min)，抽真空至0.4个大气压，冷却水慢慢放冷却至45℃待用，再加入保湿组合物相搅拌(15r/min)15分钟，均匀，38度出料，存放静置间。
[0058]
实验8、实验7保湿膏霜保湿性能的测定
[0059]
选择30名年龄在20
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55岁、皮肤健康、无化妆品过敏史的志愿者。在试验前，洗净左右前臂，晾干，在20～22℃、相对湿度为55％的恒温恒湿室里至少稳定30min，待皮肤温度和湿度与环境达到平衡后，于左右前臂上各划出3cm
×
3cm的试验区域，左臂为对照样品涂抹区，右臂为待测样品涂抹区。
[0060]
使用tewameter tm300经表皮水分散失测试探头测定受试者前臂内侧标记点在使用样品前与使用10和120min后皮肤的tewl变化，每个标记点测30s，取平均值。
[0061]
使用cm825皮肤水分测试探头测定试验部位的角质层含水率，取5次测量的平均值作为测试值，结果以mmv表示。然后取前述保湿霜按(2.0
±
0.1)mg样品/cm2的剂量涂抹于受试部位，分别于10和120min后，同法测量皮肤角质层的mmv。按式计算mmv变化率。
[0062][0063]
将实验7制得的高效保湿膏霜进行皮肤水合度(mmv)与经表皮失水率(tewl)的测定，结果如图1、图2所示。由图1、图2可知，该高效保湿膏霜是一种具较好即时保湿能力的产品，并且能较好地修复皮肤的屏障功能。用后受试者一致认为肌肤变得柔软光滑，能改善皮肤干燥的状况。
[0064]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员
来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。