月桂酰精氨酸乙酯衍生物和作为动物用抗菌剂的用途的制作方法

月桂酰精氨酸乙酯衍生物和作为动物用抗菌剂的用途
1.本技术是申请日为2018年6月22日、申请号为201810648982.3、发明名称为“月桂酰精氨酸乙酯衍生物和作为动物用抗菌剂的用途”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种月桂酰精氨酸乙酯的离子对化合物衍生物和制备方法，以及该衍生物在治疗和预防动物致病菌疾病的应用。尤其是该衍生物制备动物用抗菌剂的用途。


背景技术：

3.鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(riemerellaanatipestifer,ra)引起的一种接触性传染病，又称为鸭传染性浆膜炎、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等。多见于1
‑
8周龄的雏鸭，其中2
‑
4周龄的雏鸭最易感。呈急性或慢性败血症，临诊上主要表现为眼和鼻的分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状。在病变上以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征，常引起小鸭的大批发病和死亡。该病的发病率可达90％以上，死亡率与发病鸭日龄、菌株毒力、不良应激因素相关，最高可达75％。除可引起1～8周龄鸭死亡外，还可引起输卵管炎，造成成年鸭产蛋率下降，生长迟缓，给养殖户造成了极大的经济损失。自1982年首次报道以来，此病已成为危害肉鸭养殖业的一种最常见细菌病。在自然条件下，本病一年四季都有发生。主要通过污染的饲料、饮水、尘土、飞沫等经呼吸道、消化道或皮肤的伤口(尤其是足蹼部皮肤)进入家禽体内而引发疾病。不同品种的鸭如北京鸭、樱桃谷鸭、狄高鸭、水鸭、番鸭、半番鸭、麻鸭等都可以感染发病。2012年7月至8月对江苏省内48个养鸭场进行随机抽查，其中45个养鸭场有疑似鸭疫里默氏杆菌病病例的出现，甚至有12个养鸭场在抽查期间竟然两次爆发该病。另外，若某一养鸭场发生该病，其周围的鸭场也会相继爆发该病，由此可见该病对养鸭业造成危害的严重性。
4.金黄色葡萄球菌病是指由金黄色葡萄球菌引起多种动物不同疾病或病型的通称。致病性金黄色葡萄球菌可引起各种家禽家畜发病，幼龄畜禽对本病最易感，多经消化道感染，鸡亦可通过呼吸道感染，常见症状有腹泻、肠炎、肝脏坏死等。常引起两类疾病，一类是化脓性疾病，主要引起动物的乳房炎、关节炎、创伤感染和败血症等；另一类是毒素性疾病，被致病菌污染的饲料会引起动物的中毒性肠炎及人的毒素休克综合征等。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒力致病因子，主要包括血浆凝固酶、肠毒素、耐热核酸酶、溶血毒素和杀白细胞素等。
5.大肠杆菌病是指由致病性大肠杆菌引起多种动物不同疾病或病型的通称。病原性大肠杆菌和人畜肠道内正常寄居的非致病性大肠杆菌在形态、染色反应、培养特性和生化反应等方面没有区别，但抗原构造不同。致病性大肠杆菌可引起各种家禽家畜发病，如猪牛羊马鸡兔等，幼龄畜禽最易感本病，多经消化道感染，鸡亦可通过呼吸道感染。其中猪大肠杆菌病，根据仔猪的生长期和病原菌血清型的不同，在仔猪的临诊表现也不同，可分为黄痢型、白痢型和水肿型。仔猪发生黄痢时，常波及一窝仔猪的90％以上，病死率高，有的可达
100％；白痢的发病率为30％～80％；水肿病发病率为10％～35％。雏鸡的大肠杆菌病通常表现为急性败血型、卵黄性腹膜炎、眼炎、气囊炎肿头综合征等。发病率可达30％～60％，病死率可达100％。
6.温和气单胞菌是革兰氏阴性、兼性厌氧性细菌，常存在于各种水环境、土壤环境中，并且是一种人畜共患致病菌。温和气单胞菌能产生溶菌素、胞外酶等多种致病因子，可导致水产动物患败血症，从而引发水产动物的死亡，严重影响水产养殖的经济基础。另外，致病菌还可能通过水产品感染到人，患者会出现腹泻等症状甚至发展为食物中毒或败血症。
7.除改善饲养条件外，施加抗生素是预防和治疗畜禽水产细菌性疾病的主要措施。然而，近年来，如金霉素、土霉素、四环素、氯霉素等常用抗生素因其抗病、促生长的功效在畜禽养殖业中被大肆使用。据统计，我国每年抗生素原料生产量约为21万吨，其中有9.7万吨的抗生素用于畜禽养殖业，占总生产量的46.1％。不恰当的抗生素使用、药物质量无保障、不全面的监管以及不严谨的用药规定导致了抗生素滥用加剧，从而产生了许多过犹不及的严重问题，如细菌耐药性的产生、动物机体免疫机能下降、肉类产品药物残留等，直接危害人类的健康。有研究称，约75％的抗生素是无法被人体或动物体吸收代谢，部分会残留在体内，有20％
‑
50％的活鸡或者冻鸡组织中能够检测到抗生素残留；残留的抗生素亦可随着排泄物进入环境中，有的会直接进入河道并影响下游居民的饮水安全，我国许多沿河城市的居民自来水中都检测到过土霉素、四环素、强力霉素、阿莫西林、金霉素等畜禽业抗生素的残留。近年来有研究对上海1000名儿童尿液进行抗生素检测，58％的尿液样品中检测到了多种仅在养殖业使用的兽用抗生素(如泰乐菌素、氯四环素和恩氟沙星等)。更重要的是，这些残余的抗生素会对环境中的微生物进行自然选择或者诱发其基因突变，具备耐药性的细菌存活下来并继续繁殖出更多的耐药菌。另外，细菌还能通过接合、转化、转导、转座等方式将自己的耐药基因传递给其他不同种、属的微生物使之获得耐药性。这就使得耐药细菌在环境中富集，被污染的土壤、水源一旦被人或牲畜接触则极易引发疾病并加速耐药菌的扩散。除了违规添加抗生素或抗菌剂之外，兽药和饲料添加剂主要包括防腐剂、防尘剂、抗氧化剂、抗原虫药等。这些物质因长期使用或使用不当，就会给畜禽和人身健康带来危害。
8.因此，在水产、畜牧、家禽类的养殖中，尤其是禽类(如鸡鸭)养殖中，迫切需要一种能够快速杀菌，并在体内易降解、无残留的抗菌剂，既能有效防止养殖业中疾病发生和蔓延，还能避免类似抗生素残留对人体及环境的影响。
9.月桂酰精氨酸乙酯(ethyl lauroylarginate，lae)是一种由脂肪酸和二元氨基酸缩合而成的有机物，为白色吸湿性固体，在ph3～7范围内化学性质稳定，熔点50～58℃，该温度下247g的lae可分散于1kg的水中，它在水和油中的分配系数大于10，即主要存在于水相中。研究发现，月桂酰精氨酸乙酯lae具有抗菌能力强、生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高的特点。而其中最具代表性的特点是月桂酰精氨酸乙酯代谢无残留，相关研究显示月桂酰精氨酸乙酯在人体与动物体内可快速进行自然代谢，生成月桂酸和精氨酸，进一步被代谢为鸟氨酸、尿素、二氧化碳和水。月桂酰精氨酸乙酯代谢过程中所产生的所有初级代谢产物及终产物都是无毒无害的，与人和动物日常摄取的食物在体内的代谢产物相同。
10.例如，中国专利申请cn201710056593、发明名称为“一种果蔬防腐保鲜剂及其制备方法和应用”公开了以月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐和尼泊金甲酯钠为主要活性成分的组合物来作为果蔬防腐保鲜剂，能够有效抑制导致果蔬腐烂的细菌生长。然而，该发明中高浓度的尼泊金甲酯钠(2000μg/ml)的单独抑菌效果强于低浓度的lae(1000μg/ml)，这是因为其具有酚羟基结构，抗菌性能远远强于苯甲酸、山梨酸，因此在保证防腐性能的前提下，该方法明确指出使用尼泊金甲酯钠代替lae，有助于降低防腐剂的用量成本。
11.中国专利申请cn201510748675、发明名称为“采用月桂酰精氨酸乙酯抑制酒精发酵污染微生物的方法”公开了采用月桂酰精氨酸乙酯抑制酒精发酵污染微生物的方法，该方法包括将lae及其盐类化合物，以低于50μg/ml的浓度加入酿酒酵母的发酵液中，能有效抑制乳酸菌的生长，并控制其他污染微生物的生长。然而，该抑菌剂在一定程度上轻微影响酵母菌的生长，并导致酒精产量降低0.6％。
12.中国专利申请cn201610466729、发明名称为“一种温和的婴童洗发沐浴泡泡”公开了一种温和的婴童洗发沐浴泡泡，其针对婴童毛发及肤质的特点，选用椰油酰谷氨酸二钠、椰油酰胺丙基甜菜碱及磺酸羟丙酯月桂基葡糖苷交联聚合物钠复配作为表面活性剂体系，选用山茶籽油、α
‑
葡聚糖寡糖/菊粉复配物作为调理成分，野菊花提取物和月桂酰精氨酸乙酯hcl复配作为防腐体系，该发明中各原料互相协作，清洁效果好，温和无刺激。
13.中国专利申请cn201280073013、发明名称为“协同作用的抗微生物剂”公开通过将有效量的n
‑
α
‑
长链烷酰基二元氨基酸烷基酯盐与甘油单脂肪酸酯组合提供协同作用的抗微生物组合物，产生更有效的抗微生物剂和食品防腐剂。同时，中国专利申请cn200810131638、发明名称为“杀微生物剂组合物”公开甲基异噻唑啉酮和lae的组合物用于制备抗微生物剂和食品防腐剂的用途。然而，该方法涉及包括lae在内的多种抑菌成分，并未研究lae的单独抑菌作用。同时，该发明仅仅教导了所述组合物用于日用产品、清洁剂、伤口护理组合物、各类食品、各类医用清洁产品等用途，并未教导如何将单一的lae成分用于禽畜水产的抗菌性饲料的用途。
14.中国专利申请cn201280027864、发明名称为“具有改进的耐水性的化妆防晒制剂或皮肤科防晒制剂”公开一种lae用于制备化妆防晒制剂或皮肤科防晒制剂的用途，该制剂除了uv滤光剂之外还包括乳化剂聚甘油
‑
10硬脂酸酯。
15.作为最接近的现有技术，中国专利申请cn200580051259，发明名称为“包括阳离子表面活性剂的防腐体系”首次公开lae及其盐酸盐用于防腐体系中的用途，在食品、化妆品中添加包含0.2g/kg lae的该体系从而起到防腐作用。该发明研究了lae的抑菌机理，并提出如何将lae用于食品、化妆品等防腐作用的应用，因此美国食品安全局于2005年批准月桂酰精氨酸乙酯用于食品防腐剂；2012年欧盟食品安全局、澳大利亚和新西兰也都批准了月桂酰精氨酸乙酯用于食品防腐剂。同时，鉴于该发明首次提出在化妆品方面的应用，后续研究中发现月桂酰精氨酸乙酯可用于口腔护理方面的产品(例如us20100330136a1、ep2361606a2、ep231603a2)，如漱口水、牙膏等，可有效抑制口腔内牙斑的形成，它与漱口水中的其它化学成分兼容且化学性质稳定；月桂酰精氨酸乙酯可用于有局部治疗功效的化妆品中，这些化妆品有以下的特性：抗菌效果，低毒，没有致敏作用，对皮肤没有刺激。目前，研究人员正在研制清洁的洗手液和用于皮肤表面的抑菌剂。


技术实现要素：

16.综上所述，现有的发明并未教导如何使用单一的月桂酰精氨酸乙酯(lae)衍生物作为禽畜水产的抗菌性药物的用途，也未公开月桂酰精氨酸乙酯(lae)衍生物在作为抗菌性药物的适宜浓度。因此，本发明利用月桂酰精氨酸乙酯及其衍生物或其水合物(优选lae)作为防腐剂的抑菌效果，在本技术人的lae作为兽用抗菌剂的在先发明申请的基础上，研制新的lae衍生物，其中突破对于衍生物开发的传统思路，即不再局限于选择传统上适于lae的酸、碱、盐/酯的合适形态，或对lea进行酸、碱、盐或酯化基团的处理，而是创造性的选择一种能够增强lae的抑菌协同效应、同时又能显著补充营养能量物质的酸根基团，并将二者非常规地通过分子间强烈的离子键结合成新的衍生物，即离子对化合物，从而显著地提高了lae衍生物在作为兽用抗菌剂的用途。
17.本发明第一个目的是提供具有如下式(i)所示结构式的月桂酰精氨酸乙酯(lae)衍生物：
[0018][0019]
其中，
[0020]
x是具有抑菌作用、能量作用的有机酸rcoo
‑
；其选自水杨酸、甲酸、乙酸、双乙酸、丙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苯甲酸、山梨酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磷酸、草酸或碳酸之任意的一种或几种；
[0021]
r1是含有8
‑
14个碳原子的直链饱和脂肪酸基团、或含有8
‑
14个碳原子的直链含氧酸基团。
[0022]
r2是含1
‑
18个碳原子的直链脂肪酸基团、或含有1
‑
18个碳原子的支链脂肪酸基团、或含有1
‑
18个碳原子的芳香基团，或含1
‑
4个碳原子的直链烷基。
[0023]
r3是下列结构的一种。
[0024][0025]
n的范围是0
‑
4。
[0026]
在一个实施方案中，所述rcoo
‑
选自水杨酸、甲酸、乙酸、双乙酸、丙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苯甲酸、山梨酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磷酸、草酸或碳酸的酸根。
[0027]
在另一实施方案中，有机酸根rcoo
‑
选自烟酸、酒石酸、草酸的酸根。
[0028]
在一个具体实施方案中，本发明提供具有如下式(iii)所示结构式的月桂酰精氨酸乙酯(lae)有机酸离子对化合物：
[0029][0030]
rcoo
‑
为以下所述酸的酸根：选自水杨酸、甲酸、乙酸、双乙酸、丙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苯甲酸、山梨酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磷酸、草酸或碳酸。
[0031]
在另一实施方案中，有机酸根rcoo
‑
选自烟酸、酒石酸、草酸的酸根。
[0032]
本发明第二目的是提供上述lae衍生物用于制备治疗或预防禽畜、水产动物的致病菌感染的药物的用途。
[0033]
在一个实施方案中，所述药物是用于治疗或预防雏鸭感染致病性革兰氏阴性菌的药物，并且该药物以每千克体重给予4
‑
40mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用。在一个优选实施方案中，该药物以每千克体重给予8
‑
16mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用，所述致病性革兰氏阴性菌是鸭疫里默氏杆菌。在最优选实施方案中，该药物以每千克体重给予16mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用以治疗雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的疾病，或给予8mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用以预防雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的疾病。
[0034]
在另一实施方案中，所述药物是用于治疗或预防禽畜、水产动物的致病性革兰氏阴性菌疾病的药物，并且该药物以每千克体重给予0.625
‑
10mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用。在一个优选实施方案中，所述剂量为2.5
‑
10mg，所述致病性革兰氏阴性菌是里默氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、嗜血杆菌、布鲁氏菌或温和气单胞菌。
[0035]
在其他实施方案中，所述药物是用于治疗或预防禽畜、水产动物的革兰氏阳性菌疾病的药物，并且该药物以每千克体重给予2.5
‑
25mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用。在优选实施方案中，所述革兰氏阳性菌是金黄色葡萄球菌、链球菌、丹毒杆菌、分枝杆菌、炭疽杆菌，并且该药物以每千克体重给予2.5、10或25mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用。
[0036]
还在其他实施方案中，所述药物是用于治疗仔猪腹泻的药物，并且该药物以每千克体重给予10
‑
50mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用仔猪。在优选实施方案中，所述药物以每千克体重给予30
‑
50mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用仔猪，并取得优于同剂量抗生素的治疗仔猪腹泻的效果。在最优选的实施方案中，所述药物以每千克体重给予50mg式(i)或(iii)所示的化合物的剂量进行施用仔猪，并取得优于同剂量抗生素的治疗仔猪腹泻的效果。
[0037]
在另一实施方案中，所述包含所示的化合物的药物的剂型包括颗粒剂、溶液剂、悬浮剂、粉剂、胶囊剂、油剂、膏剂。
[0038]
在上述任一实施方案中，所述禽畜、水产动物包括：鸡鸭鹅火鸡鹌鹑家鸽，猪牛羊马骆驼猫狗，以及鱼虾蟹等，所述致病菌包括但不局限于黄白痢、气喘病、丹毒病、水肿病、
梭菌性肠炎、增生性肠炎、结核病、巴氏杆菌病、炭疽杆菌病、沙门杆菌病。
[0039]
本发明还提出了式(i)或(iii)所示的衍生物在制备用于改变微生物的细胞膜极性的药物中的应用。
[0040]
在一个优选的实施方案中，所述所示的化合物能在30min内杀灭致病微生物，并且不引发耐药菌的出现。在另一优选的实施方案中，所述所示的化合物能连续30天刺激致病微生物而不引发耐药菌的出现。在更优选的实施方案中，所述所示的化合物对正常哺乳动物细胞毒性低。在最小杀菌浓度下不引发红细胞溶血。
[0041]
在另一具体实施方案中，所述所示的化合物对健康雏鸭生存率无影响，对健康雏鸭体重增长无影响，对健康雏鸭脏器无毒性，且能降低由于细菌感染而上升的动物体内炎症因子il
‑
1β和/或il
‑
1β蛋白水平。
[0042]
本发明第三个目的是提供如式(iii)所示的月桂酰精氨酸乙酯衍生物或其水合物或药学上可接受的盐，用于改变微生物的细胞膜极性的方法，步骤包括：
[0043]
(1)将致病性微生物溶液稀释至od600＝0.05，然后加入细胞膜极性染料；
[0044]
(2)加入式(i)或(iii)所示的衍生物溶液直至终浓度为16μg/ml，充分反应；
[0045]
(3)以622nm波长的光为激发光，测量670nm处的荧光值；
[0046]
(4)通过流式细胞仪检测每个样品的荧光值，通过计算比值得出细菌细胞膜发生去极化的程度。
[0047]
本发明第四个目的是提供如式(iii)所示的月桂酰精氨酸乙酯(lae)衍生物的制备方法，其步骤包括：
[0048]
(1)加热溶解式(ii)所示的化合物，而后加入有机酸盐溶液；
[0049][0050]
(2)充分搅拌混匀，并在加热的条件下，通过下述反应式生式(iii)所示月桂酰精氨酸乙酯离子对化合物；
[0051][0052]
(3)充分反应后，冷却室温，纯化后真空干燥，从而制备式(ii)所示的月桂酰精氨酸乙酯有机酸离子对化合物。
[0053]
在一个实施方案中，有机酸根rcoo
‑
选自以下酸的酸根：水杨酸、甲酸、乙酸、双乙酸钠、丙酸、丁酸、乳酸、苯甲酸、山梨酸、富马酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、磷酸、草酸或碳酸；以及选自具有为动物补充营养能量的烟酸、泛酸、叶酸、抗坏血酸。在一个优选实施方案中，所述有机酸选自烟酸、酒石酸、草酸、碳酸的酸根。
[0054]
在另一实施方案中，将所述有机酸加入甲醇溶液中，并加入适量的naoh，室温搅拌直至析出白色固体，抽滤并用甲醇分洗涤，得到有机酸盐。
[0055]
本发明的有益效果在于：
[0056]
研究证明，烟酸属于b族维生素，烟酸参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程。主要由植物、微生物合成(某些动物也可通过色氨酸而实现自身合成，但合成量远远不够自身所需)，在动物体内无法大量储存却又是动物生长所不可缺少的物质。反刍动物可以通过瘤胃中的微生物来提供，家禽和猪则依靠饲料进行外源补充。烟酸缺乏症有以下表现：家禽表现羽毛稀少而蓬松无光泽皮肤和足部皮炎骨短粗腿弯曲；家畜表现皮炎、食欲下降和消瘦。根据我国2013版饲料添加剂品种目录，烟酸属于维生素类添加剂可用于各种养殖动物，有利于养殖动物的健康生长。
[0057]
酒石酸是存在于多种植物里的一种有机酸，也是葡萄酒中的主要有机酸，常用于食品添加起抗氧化剂的作用。草酸也是一种存在于许多绿色植物中的有机酸，如菠菜、红薯、芋头以及大黄等，另外可可豆中也含有大量草酸。因此本发明希望将lae与这些无毒甚至有利于动物健康的有机酸合成离子对，来提升lae的抗病或者促生长功能。
[0058]
本发明通过实验，选用具有一定抑菌能力、发挥营养(如烟酸)或能量(草酸)作用或作为生物代谢所需的有机酸，通过缩合反应与lae生成单一的离子对化合物，能够改变单体分子溶解性、稳定性等理化性质，既可发挥各自活性，也可产生协同作用，从而提高生物利用度，进一步提升药物疗效；同时又易于穿透亲脂性的细胞膜，改善吸收。
[0059]
本发明证明了式(iii)所示的衍生物相对于式(i)所示的lae化合物，还具有如下优点：
[0060]
1、本发明的式(iii)所示的衍生物不会对单一成分的原lae的抗菌活性产生抑制作用，相反有益于抗菌活性。其中，烟酸离子对衍生物相比于lae对金黄色葡萄球菌产生了显著的抑菌效果。
[0061]
2、本发明的式(iii)所示的衍生物连续给药30天不诱发致病微生物的耐药突变，并且相对于市售抗生素诱发细菌耐药能力低，该衍生物相对于lae诱发金黄色葡萄球菌耐药的能力减弱。
[0062]
3、本发明的式(iii)所示的衍生物在最小杀菌浓度下不引发红细胞溶血现象。
[0063]
4、本发明的式(iii)所示的衍生物能够提升已感染鸭疫里默氏杆菌的雏鸭存活率，降低雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的风险，并对健康雏鸭生存率无影响，并且相比于lae衍生物的效果，其用药量更低，治疗效果更好
[0064]
5、本发明的式(iii)所示的衍生物作为药物的有效剂量范围明显低于lae的生产需要的上限剂量范围40mg/kg bw
[0065]
6、本发明的式(iii)所示的衍生物能够恢复动物体内由于细菌感染而引起的炎症因子il
‑
1β、tnf
‑
α的蛋白水平的升高。
[0066]
7、实验证明，给药3个月后停药24h，给药组动物的心、肝、脾、肺、肾、小肠、胃、肌肉组织药物残留量符合欧盟对未规定兽药残留量的要求。
[0067]
8、实验证明，所述式(iii)所示的衍生物既能防治水产动物的细菌性疾病，还能够促进家禽水产动物的营养生长，其中：抗感染实验结果显示，食用未含式(iii)所示的衍生物饲料的试验鱼全部死亡，食用含有式(iii)所示的衍生物的罗非鱼存活率可达91.67
±
2.89，高于lae的88.33
±
7.63存活率；对于罗非鱼，能够提高相对增重率3.52％、6.91％、4.64％和特定生长率7.94％、13.08％、6.54％，降低饲料系数4.76％、5.56％、2.38％，均高于lae的相对增重率3.03％、6.23％、3.88％和特定生长率12.32％，降低饲料系数3.15％。
[0068]
9、实验证明，与同剂量的庆大霉素相比，所述式(iii)所示的化合物能更有效地治疗仔猪腹泻，并避免了抗生素的使用，减少了牲畜中的抗生素的残留。
[0069]
10、月桂酰精氨酸乙酯衍生物在人体及动物体内可安全降解，毒副作用小，避免了由于残留的抗菌剂排放到环境中所引起的环境耐药菌的产生，在达到有效抗菌效果的同时对环境负面影响小。
附图说明
[0070]
图1：lae离子对化合物的阳离子b 分子离子峰的esi质谱图；
[0071]
图2：lae烟酸离子对化合物的阴离子a
‑
分子离子峰的esi质谱图；
[0072]
图3：lae的1h
‑
nmr的峰形和化学位移图；
[0073]
图4：烟酸的1h
‑
nmr的峰形和化学位移图；
[0074]
图5：lae烟酸离子对的1h
‑
nmr的峰形和化学位移图；
[0075]
图6：lae酒石酸离子对化合物的阴离子a
‑
分子离子峰的esi质谱图。
具体实施方式
[0076]
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变
化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0077]
实施例一：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与烟酸合成离子对化合物的制备方法
[0078]
将烟酸钠(购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)2.0g溶于50ml水中，配制成烟酸钠盐水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐6.8g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将烟酸钠盐水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得烟酸离子对化合物7.6g。
[0079]
实施例二月桂酰精氨酸乙酯烟酸离子对化合物分子式、分子量的分析
[0080]
通过质谱、1h
‑
nmr、
13
c
‑
nmr波谱分析所得到的化合物分子式为：
[0081]
1.质谱(esi)分析
[0082]
阳离子b

分子离子峰的m/z＝385.3，参见图1；
[0083]
质谱检测esi 为124.2，参见图2。则esi
‑
为122.2，即阴离子a
‑
分子离子峰的m/z＝122.2。
[0084]
烟酸离子对化合物中阳离子的理论计算值为507.4，实测值与理论值吻合。
[0085]
2.nmr分析
[0086]
将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(参见图3)、烟酸的1h
‑
nmr(参见图4)和离子对化合物的1h
‑
nmr(参见图5)相比较。由于lae离子对化合物在成盐过程中，在该离子对化合物中月桂酰精氨酸乙酯的峰形及化学位移变化不大，但烟酸上的所有氢都有位移变化，其波谱特征与原无机酸盐(即lae盐酸盐)相比，酸碱两部分空间距离更加接近，产生影响，因此其与原lae及其盐酸盐相比，产生相应变化，并不是简单的酸碱两部分的迭加，例如在纯净水洗涤沉淀时，溶解性已发生改变，这说明月桂酰精氨酸乙酯的所有氢核与烟酸之间产生了强相互作用，并通过强烈的离子键形成了稳定的单一化合物结构。
[0087]
实施例三：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与酒石酸合成离子对化合物的制备方法
[0088]
将酒石酸(购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)2.0g溶于50ml甲醇中，加入当量的naoh，室温搅拌直至析出白色固体，抽滤并用30ml甲醇分三次洗涤，得到酒石酸钠盐。酒石酸钠盐溶于50ml水中，配制成酒石酸钠盐水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐5.6g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将酒石酸钠盐水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得酒石酸离子对化合物6.3g。
[0089]
实施例四月桂酰精氨酸乙酯酒石酸离子对化合物分子量的分析
[0090]
质谱(esi)分析阳离子b

分子离子峰的m/z＝385.3(参见图1)
[0091]
阴离子a
‑
分子离子峰的m/z＝149.0(参见图6)
[0092]
烟酸离子对化合物中阳离子的理论计算值为534.3，实测值与理论值吻合。
[0093]
实施例五：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与草酸合成离子对化合物的制备方法
[0094]
将草酸(购于探索有限公司)1.0g溶于50ml甲醇中，加入当量的naoh，室温搅拌直
至析出白色固体，抽滤并用30ml甲醇分三次洗涤，得到草酸钠盐。草酸钠盐溶于50ml水中，配制成草酸钠盐水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐4.7g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将草酸钠盐水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得草酸离子对化合物5.0g。
[0095]
按照实施例二的方法，进行nmr分析和esi分析，结果表明该离子对化合物的波谱特征不是简单的酸碱两部分的迭加，酸碱两部分空间距离接近，产生影响，其波谱数据与原lae及其盐酸盐相比，产生相应变化，例如在纯净水洗涤沉淀时，溶解性已发生改变，这说明月桂酰精氨酸乙酯的所有氢核与草酸之间产生了强相互作用，并通过强烈的离子键形成了稳定的单一化合物结构。
[0096]
实施例六：月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐与碳酸合成离子对化合物的制备方法
[0097]
将碳酸钠(购于探索有限公司)1.0g溶于50ml水中，配制成碳酸钠水溶液(a)；将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐4.0g溶于40ml水中，加热至90℃，直至月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐全部溶解，制成月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)；在90℃条件下将碳酸钠水溶液(a)缓慢加入到月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐水溶液(b)中，不断搅拌，反应2小时，冷却至室温，过滤，用纯净水充分洗涤沉淀，沉淀60℃真空干燥，即得碳酸离子对化合物4.0g。
[0098]
按照实施例二的方法，进行nmr分析和esi分析，结果表明该离子对化合物的波谱特征不是简单的酸碱两部分的迭加，酸碱两部分空间距离接近，产生影响，其波谱数据与原lae及其盐酸盐相比，产生相应变化，这说明月桂酰精氨酸乙酯的所有氢核与碳酸之间产生了强相互作用，并通过强烈的离子键形成了稳定的单一化合物结构。
[0099]
实施例七：月桂酰精氨酸乙酯离子对化合物体外最小抑菌浓度(mic)的测定
[0100]
原理与目的：根据clsi规定的微量肉汤稀释法，药物与细菌在96孔板内共孵育24h后，细菌生长被抑制的最小药物浓度为该药的最小抑菌浓度。
[0101]
方法：将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(lae)及上述所制备的月桂酰精氨酸乙酯有机酸离子对分别用胰酪胨大豆肉汤培养基(tsb)二倍稀释成不同浓度，药物与细菌在96孔板里混合孵育，另设无细菌的空白对照培养基ck1和添加lae(1000μg/ml)的培养基ck2以及不含药物的细菌正常生长对照培养基ck3。将96孔板放入37℃温箱中孵育24h后测定各孔625nm处的吸光光度值。与空白对照od
625
值一致的孔视为细菌无明显生长。细菌无明显生长的药物最低浓度为lae对细菌的最小抑菌浓度mic(minimal inhibitory concentration)。
[0102]
所制备的多种lae衍生物(离子对化合物)相对于原lae化合物的抗菌活性的比较结果如下表1所示。
[0103]
表1 lae及其离子对化合物对三种细菌的体外抗菌效果
[0104]
[0105][0106]
结果分析：
[0107]
(1)离子对化合物大部分对大肠杆菌保持相同的抗菌活性，尤其是草酸离子对化合物的抗菌活性上升；
[0108]
(2)离子对化合物大部分对金黄色葡萄球菌保持相同的抗菌活性，碳酸离子对化合物的抗菌活性下降，烟酸离子对化合物的抗菌活性显著上升；
[0109]
(3)离子对化合物大部分对鸭疫李默式杆菌保持相同的抗菌活性，尤其是碳酸离子对化合物的抗菌活性明显上升。
[0110]
结论：lae衍生物的离子对化合物，不会对单一成分的原lae的抗菌活性产生抑制作用，相反有益于抗菌活性。其中，烟酸离子对化合物对金黄色葡萄球菌产生了显著的抑菌效果。
[0111]
实施例八：月桂酰精氨酸乙酯离子对化合物诱发细菌耐药实验
[0112]
原理与目的：细菌在亚抑菌浓度下能够被诱发产生对该药物的耐药菌，通过长期将亚抑菌浓度药物培养的细菌转接到新鲜的含药培养基中来检测该药物诱发细菌产生耐药突变的能力。
[0113]
方法：对数期的细菌与lae有机酸离子对溶液混合于玻璃试管，棉塞封口，放置于37℃、220rpm的恒温摇床培养24h。之后每隔24h检查药物的mic，并将能培养出浑浊菌液的最高药物浓度(即低于mic的最高药物浓度)的菌液以1:100的比例再次加入到含有不同药物浓度的新鲜培养基里，37℃、220rpm培养24h，持续30天氯霉素为阳性对照组。计算30天后药物对细菌mic与初始mic的比值。
[0114]
表2 lae及其离子对化合物连续刺激细菌30天后的mic/初始mic的比值
[0115][0116][0117]
结果显示，lae有机酸离子对刺激细菌30天，并不会使细菌产生耐受，鸭疫李默式
杆菌和大肠杆菌也不对lae产生耐受，金黄色葡萄球菌仅对lae单一成分产生微弱的耐受抵抗。而氟苯尼考、氯霉素、氨苄青霉素诱发细菌耐药的能力非常强，30天最小抑菌浓度上升到初始的6
‑
16倍不等。因此lae及其离子对相对于市售抗生素诱发细菌耐药能力低，lae离子对相对于lae诱发金黄色葡萄球菌耐药的能力减弱。
[0118]
实施例九：月桂酰精氨酸乙酯烟酸离子对化合物对禽畜的细菌性疾病防治效果
[0119]
1.lae烟酸离子对对感染鸭疫里默氏杆菌雏鸭的口服治疗效果
[0120]
原理与目的：雏鸭感染细菌后，口服lae烟酸离子对观察动物的存活情况，研究lae烟酸离子对对已患细菌性疾病家禽的治疗效果。
[0121]
方法：雏鸭50只随机分成5组，每组10只。将鸭疫里默氏杆菌以4
×
106cfu的量皮下注射接种在四组雏鸭腿部设为感染组，另一组不做任何处理设为空白组。12h后4个感染组分别以灌胃的形式给不同剂量的lae水溶液或者空白水溶液对照组，在给药后1h、7h、12h、24h、48h、72h、96h分别进行观察并记录死亡情况，96h动物存活情况见表3
‑
1，lae治疗效果见表3
‑
2。
[0122]
表3
‑
1：口服lae烟酸离子对对已感染鸭疫李默氏杆菌的雏鸭的治疗效果
[0123][0124]
表3
‑
2：口服lae的治疗效果(参见在先申请201711071006.8)
[0125][0126]
注：试验组为感染致病菌并给不同浓度lae或其烟酸离子对的动物；
[0127]
空白组为未接触致病菌的动物；
[0128]
对照组为感染致病菌但未给药lae或其烟酸离子对的动物。
[0129]
结果显示：
[0130]
(1)未口服lae或其离子对衍生物的患有鸭疫里默氏杆菌病的雏鸭死亡率均为100％；
[0131]
(2)患病后口服4毫克每千克体重lae烟酸离子对的患病雏鸭死亡率降到80％，而给药lae的雏鸭死亡率仍为100％；
[0132]
(3)口服8毫克每千克体重lae烟酸离子对的患病雏鸭死亡率仅为30％，而给药lae的雏鸭死亡率仍为60％；
[0133]
(4)口服16毫克每千克体重lae烟酸离子对使死亡率降低到20％，而给药lae的雏鸭死亡率仍为40％；
[0134]
结论：口服lae烟酸离子对可以治疗雏鸭的鸭疫里默氏杆菌病，并且相比于lae化合物的效果，其用药量更低，治疗效果更好。
[0135]
2.lae烟酸离子对对雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的防治效果
[0136]
原理与目的：感染细菌前，雏鸭口服lae离子对，感染后继续每日口服lae离子对，观察动物存活情况，研究lae离子对作为抗菌剂保护家禽不受细菌侵染的效果。
[0137]
方法：雏鸭50只随机分成5组，每组10只。其中2个组以灌胃的形式给空白水溶液做未给药组，另外3组以灌胃的形式给lae烟酸离子对水溶液做试验组。第一次给药后8h将鸭疫里默氏杆菌以4
×
106cfu的量皮下注射接种在三组实验组以及一组未给药对照组的雏鸭腿部为感染组，另1组未给药组不做任何处理做未感染组(即不感染细菌也不给药作为空白)。分别在感染后12h、24h、48h对未感染组和感染未给药组以灌胃的形式给空白水溶液，实验1、2、3组分别给不同浓度的lae烟酸离子对水溶液。在给药后1h、7h、12h、24h、48h、72h、96h分别进行观察并记录死亡情况，96h的存活情况结果见表4
‑
1。lae预防效果见表4
‑
2。
[0138]
表4
‑
1：口服lae离子对衍生物对雏鸭抵抗鸭疫李默氏杆菌感染的防治效果。
[0139][0140]
表4
‑
2：口服lae对雏鸭抵抗鸭疫李默氏杆菌感染的防治效果(参见在先申请201711071006.8)
[0141][0142]
注：试验组为感染致病菌并给不同浓度lae或其衍生物离子对的动物；
[0143]
空白组为未接触致病菌且未给药或其烟酸离子对的动物；
[0144]
对照组为感染致病菌但未给药或其烟酸离子对的动物。
[0145]
结果分析：
[0146]
(1)未口服lae或其烟酸离子对衍生物的感染致病菌的雏鸭死亡率均为100％；
[0147]
(2)感染前口服4毫克每千克体重lae烟酸离子对的患病雏鸭死亡率降到50％；
[0148]
(3)感染前口服8毫克每千克体重lae烟酸离子对的患病雏鸭死亡率仅为10％，而给药lae的雏鸭死亡率仍为30％；
[0149]
(4)感染前口服16毫克每千克体重lae的患病雏鸭死亡率仅为20％，不及口服8毫克每千克体重lae烟酸离子对的防治效果；
[0150]
(5)感染前口服40毫克每千克体重lae烟酸离子对的患病雏鸭死亡率仍为10％，而给药lae的雏鸭死亡率也为10％；
[0151]
结论：在雏鸭感染细菌前口服lae烟酸离子对相比于感染后给药，这种摄取方式能够将雏鸭的生存率再次提高，并相对于lae化合物，8毫克即已获得后者的最大防治效果。因此口服剂量为4
‑
40mg/kg bw的lae已经能有效防治雏鸭感染鸭疫李默氏杆菌。持续给药能更大程度地发挥防治疾病效果。溶剂对照组的10只雏鸭在96h内全部死亡，给药组在实验结束时仍有9只存活，生存率达到90％。考虑到4
‑
8天的治疗周期以及lae治疗溶剂的成本，因此推荐lae烟酸离子对10
‑
20mg/kg bw的剂量范围已经是生产需要的上限，明显低于lae的生产需要的上限剂量范围40mg/kg bw。
[0152]
3.lae烟酸离子对给药对感染革兰氏阴性菌、阳性菌小鼠的治疗效果。
[0153]
原理与目的：能够口服摄取并发挥疗效，是对抗菌剂的较高要求，因此我们用小鼠代表家畜，分别用革兰氏阴性菌大肠杆菌来感染小鼠，之后通过口服lae离子对来评估药物对动物的治疗效果。
[0154]
方法：50只balb/c小鼠随机分为5组，每组10只。将对数期的细菌以108cfu的量注射到4组小鼠的腹腔，另一组不做任何处理设为未感染组。1h后1个感染组口服0.5ml的生理盐水，另外三个感染组分别口服不同浓度的lae离子对溶液。统计24h后的小鼠存活情况，得到表5
‑
1、表6的结果。lae的革兰氏阴性菌大肠杆菌治疗效果如表5
‑
2所示。
[0155]
表5
‑
1口服lae烟酸离子对衍生物对小鼠腹腔感染大肠杆菌的治疗效果
[0156][0157]
表5
‑
2：口服lae对小鼠腹腔感染大肠杆菌的治疗效果(参见在先申请201711071006.8)
[0158][0159]
注：
[0160]
试验组为感染致病菌并口服不同浓度lae或其烟酸离子对的动物；
[0161]
空白组为未接触致病菌的动物；
[0162]
对照组为感染致病菌但未给药组。
[0163]
结果分析：
[0164]
(1)感染后给药0.625毫克每千克体重lae烟酸离子对将小鼠体内致病菌清除率为25.6％，效果优于同剂量的lae，后者清除率仅为21.9％；
[0165]
(2)感染后给药2.5毫克每千克体重lae烟酸离子对将小鼠体内致病菌清除率为51.2％，效果优于同剂量的lae，后者清除率仅为44.21％；
[0166]
(3)感染后给药10毫克每千克体重lae烟酸离子对将小鼠体内致病菌清除率为41.6％，效果优于同剂量的lae，后者清除率仅为33.95％；
[0167]
结论：在小鼠感染细菌后给药lae烟酸离子对相比于给药lae化合物，对体内的致病菌清除效果更好，且给药剂量更低。
[0168]
按照上述相同的方法，单独测试lae烟酸离子对给药对感染革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)小鼠的治疗效果，结果见表6
‑
1。lae的革兰氏阴性菌大肠杆菌治疗效果如表6
‑
2所示。
[0169]
表6
‑
1口服lae烟酸离子对衍生物对小鼠腹腔感染金黄色葡萄球菌的治疗效果
[0170][0171][0172]
表6
‑
2口服lae对小鼠腹腔感染金黄色葡萄球菌的治疗效果
[0173][0174]
注：
[0175]
试验组为感染致病菌并口服不同浓度lae烟酸离子对的动物；
[0176]
空白组为未接触致病菌的动物；
[0177]
对照组为感染致病菌但未给药组。
[0178]
结果分析：
[0179]
(1)感染后给药2.5毫克每千克体重lae烟酸离子对将小鼠体内致病菌清除率为62.7％，效果优于同剂量的lae，后者清除率仅为61.5％；
[0180]
(2)感染后给药10毫克每千克体重lae烟酸离子对将小鼠体内致病菌清除率为60.8％，效果优于同剂量的lae，后者清除率仅为50.2％；
[0181]
(3)感染后给药25毫克每千克体重lae烟酸离子对将小鼠体内致病菌清除率为
67.2％，效果优于同剂量的lae，后者清除率仅为61％。
[0182]
实施例十：月桂酰精氨酸乙酯离子对化合物作为饲料添加剂用于哺乳动物的疾病预防
[0183]
将所述lae烟酸离子对的有效成分按照饲料总重量计，以0.01％～1.0％直接将本品添加到小鼠饲料中；或将本品与载体混合制成预混剂；或与其它饲料添加剂或饲料原料混合制成预混料、浓缩料形式饲喂小鼠。
[0184]
选用6周龄小鼠50只，按体重相近的原则随机分成5个处理组。对照组饲喂玉米小麦豆粕型日粮，试验组饲喂玉米小麦豆粕型并添加饲料总重量0.01％、0.1％、1％的lae烟酸离子对，饲养7天后，测定小鼠对大肠杆菌的抗病能力。结果见表7
‑
1。以lae化合物作为饲料添加剂的喂养效果见表7
‑
2。
[0185]
表7
‑
1：饲料添加lae烟酸离子对衍生物对哺乳动物的疾病防治
[0186][0187]
表7
‑
2：饲料添加lae对哺乳动物的疾病防治(参见在先申请201711071006.8)
[0188][0189]
注：
[0190]
试验组是接触致病菌并添加不同剂量lae或其烟酸离子对的饲料；
[0191]
空白组未接触致病菌；
[0192]
对照组是接触致病菌但未添加lae或其烟酸离子对的饲料
[0193]
结果分析：
[0194]
(1)未投放lae或其烟酸离子对衍生物饲料的感染致病菌的动物死亡率均为
100％；
[0195]
(2)饲料中含0.01％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为60％，高于同等条件下lae的喂养效果50％；
[0196]
(3)饲料中含0.1％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为80％，高于同等条件下lae的喂养效果70％；
[0197]
(4)饲料中含1％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为90％，高于同等条件下lae的喂养效果80％；
[0198]
结论：从上表可见，所有试验组的小鼠存活率比较对照组都有显著上升，其中最佳组为试验3组，成活率为90％，未添加lae烟酸离子对的对照组实验动物全部死亡，说明lae烟酸离子对作为饲料添加剂对哺乳动物疾病具有防治作用，并相对于lae化合物作为饲料添加剂具有更好的防治效果。考虑到治疗周期以及lae烟酸离子对治疗剂的成本，lae烟酸离子对作为药物或饲料添加剂的有效浓度为0.01
‑
1％、优选0.1
‑
1％已经能有效防治发病，符合生产的需要。
[0199]
实施例十一：lae烟酸离子对作为营养能量添加剂用于哺乳动物的营养生长
[0200]
按照实施例五确定的lae烟酸离子对的浓度适用范围，在各组日粮配方相同的基础上，试验1、2、3组分别将lae离子对以0.3％、0.6％、0.9％质量比添加于全价配合饲料中，对照组不添加任何药物。40只6周龄balb/c小鼠随机分为4组，正式试验开始时称取各组第1天的体重，15日后再次称取小鼠体重。结果如表8
‑
1所示。lae促进营养生长效果的结果如表8
‑
2所示。
[0201]
表8
‑
1：饲料添加lae离子对衍生物对哺乳动物生长的影响
[0202][0203]
表8
‑
2：饲料添加lae对哺乳动物生长的影响(参见在先申请201711071006.8)
[0204]
[0205]
注：
[0206]
试验组是添加不同剂量lae及其离子对的饲料；
[0207]
对照组是未添加lae或其离子对的饲料
[0208]
结果分析：
[0209]
(1)未投放lae或其烟酸离子对衍生物饲料的动物平均日增重几乎一致，且均为同组试验中最低水平；
[0210]
(2)投放0.3％、0.6％、0.9％烟酸离子对衍生物饲料的动物的日增重均略高于投放相同比例的lae饲料的水平；
[0211]
(3)从15天平均个体净增重看，两种喂养试验中，均是2组水平明显高于1、3组。
[0212]
由此表明，试验期间与对照组比，在小鼠饲料中添加0.6％lae烟酸离子对，显著提高小鼠的平均增重12.5％(而lae的增重水平仅9.64％)。因此，饲料添加lae烟酸离子对能够促进哺乳动物的生长。
[0213]
实施例十二：lae烟酸离子对作为饲料添加剂用于雏鸭的疾病防治
[0214]
将所述lae烟酸离子对的有效成分按照饲料总重量计，为0.01％～1.0％，直接将本品添加到雏鸭饲料中；或将本品与载体混合制成预混剂；或与其它饲料添加剂或饲料原料混合制成预混料、浓缩料形式饲喂雏鸭。
[0215]
选用14日龄樱桃雏鸭50只，按体重相近的原则随机分成5个处理组。每个处理设1个重复(栏)，每栏10只(雌雄各半)。对照组饲喂玉米豆粕型日粮，试验组饲喂玉米豆粕型并添加饲料总重量0.01％、0.1％、1％的lae烟酸离子对，饲养7天后，测定雏鸭对鸭疫里默氏杆菌病抗病能力。结果见表9
‑
1。喂养lae化合物作为饲料添加剂的结果见表9
‑
2。
[0216]
表9
‑
1：饲料添加lae离子对衍生物对雏鸭的疾病防治效果：
[0217][0218]
表9
‑
2：饲料添加lae对雏鸭的疾病防治效果(参见在先申请201711071006.8)
[0219][0220]
注：
[0221]
试验组是添加不同剂量lae及其烟酸离子对的饲料；
[0222]
空白组未接触致病菌；
[0223]
对照组是未添加lae或其烟酸离子对的饲料
[0224]
结果分析：
[0225]
(1)未投放lae或其烟酸离子对衍生物饲料的感染致病菌的动物死亡率均为100％；
[0226]
(2)饲料中含0.01％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为70％，同等添加条件下lae的喂养的存活率为60％；
[0227]
(3)饲料中含0.1％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为90％，同等条件下lae的喂养存活率为80％；
[0228]
(4)饲料中含1％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为90％，与同等条件下lae的喂养效果相同；
[0229]
结论：从上表可见，所有试验组的雏鸭存活率比较对照组都有显著上升，其中最佳组为试验3组，成活率为90％，未添加lae烟酸离子对的对照组实验动物全部死亡，说明lae烟酸离子对作为饲料添加剂对雏鸭疾病具有防治作用，考虑到治疗周期以及lae烟酸离子对治疗剂的成本，因此lae烟酸离子对作为药物或饲料添加剂的有效浓度为0.01
‑
1％时能有效防治发病，符合生产的需要。
[0230]
实施例十三、lae烟酸离子对作为营养能量添加剂用于雏鸭的疾病预防和营养生长
[0231]
按照实施例七确定的lae烟酸离子对的浓度适用范围，在各组日粮配方相同的基础上，试验1、2、3组分别将lae离子对以0.3％、0.6％、0.9％质量比添加于全价配合饲料中，对照组不添加任何药物。试验开始时称取各组动物第1天体重，15日后再次称取体重并测定各组对鸭疫里默氏杆菌病抗病能力。结果如表10
‑
1所示。lae的饲养效果见表10
‑
2。
[0232]
表10
‑
1：饲料添加lae烟酸离子对衍生物对雏鸭的疾病防治及营养生长效果
[0233][0234]
表10
‑
2：饲料添加lae对雏鸭的疾病防治及营养生长效果(参见在先申请201711071006.8)
[0235][0236]
注：
[0237]
试验组是添加不同量lae或其烟酸离子对的饲料；
[0238]
对照组是未添加lae或其烟酸离子对的饲料
[0239]
结果分析：
[0240]
(1)未投放lae或其烟酸离子对衍生物饲料的感染致病菌的动物患病率均为100％；
[0241]
(2)饲料中含0.3％、0.6％、0.9％烟酸离子对衍生物的饲料，动物患病率为20％，与同等条件下lae的喂养效果相同；
[0242]
(3)未投放lae或其烟酸离子对衍生物饲料的动物平均日增重几乎一致，且均为同组试验中最低水平；
[0243]
(4)投放0.3％、0.6％、0.9％烟酸离子对衍生物饲料的动物的日增重均略高于投放相同比例的lae饲料的水平；
[0244]
(5)从15天平均个体净增重看，两种喂养试验中，均是2组水平明显高于1、3组。
[0245]
结论：由此表明，试验期间与对照组比，在雏鸭饲料中添加0.3％
‑
0.9％的lae离子对均能提升雏鸭的平均增重，其中0.6％lae离子对增重作用最明显，相较于对照组显著提高雏鸭的平均增重11.5％。因此，lae离子对既能减少雏鸭由鸭疫里默氏杆菌病引起的死亡，又能提高雏鸭生长性能，促进其营养生长。
[0246]
考虑到生长周期以及lae离子对饲料添加剂的成本，因此lae离子对作为饲料添加剂的有效浓度为0.3
‑
0.9％、优选0.6
‑
0.9％、最优选0.6％时能有效防治发病，符合生产的需要。
[0247]
实施例十四：lae烟酸离子对作为营养能量添加剂用于水产动物的疾病预防和营
养生长
[0248]
选用体重为40.9
±
0.18g的240尾罗非鱼分为4个处理组，分别添加不同梯度水平的lae烟酸离子对，每组3个重复，每重复20尾鱼。通过8周的生长试验，来评价lae烟酸离子对对罗非鱼生长性能的影响。饲养同时，为探究lae烟酸离子对对水产动物抗细菌性疾病的能力，将喂养含有lae烟酸离子对饲料8周的罗非鱼进行温和气单胞菌感染，以感染后罗非鱼的存活率来体现其抗病力。结果见表11
‑
1。喂养lae的效果见表11
‑
2。
[0249]
表11
‑
1饲料添加lae烟酸离子对衍生物对罗非鱼营养生长的影响
[0250][0251][0252]
表11
‑
2饲料添加lae对罗非鱼营养生长的影响(参见在先申请201711071006.8)
[0253][0254]
注：
[0255]
试验组是添加不同剂量lae或其烟酸离子对的饲料；
[0256]
对照组是未添加lae或其烟酸离子对的饲料
[0257]
结果分析：
[0258]
(1)未投放lae或其烟酸离子对衍生物饲料的感染致病菌的动物存活率均为0％；
[0259]
(2)饲料中含0.01％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为63.66％，且相对增重率为250.1％，均高于同等条件下lae的喂养成活率和相对增重率；
[0260]
(3)饲料中含0.1％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为80％，且相对增重率为258.3％，均高于同等条件下lae的喂养成活率和相对增重率；
[0261]
(4)饲料中含1％烟酸离子对衍生物的饲料，动物成活率为63.66％，且相对增重率为250.1％，均高于同等条件下lae的喂养成活率和相对增重率；
[0262]
(5)从8周的平均个体净增重看，两种喂养试验中，均是2组水平明显高于1、3组。结论：在罗非鱼的饲料中添加lae烟酸离子对可以提高相对增重率3.52％、6.91％、4.64％和特定生长率7.94％、13.08％、6.54％，降低饲料系数4.76％、5.56％、2.38％，促进了罗非鱼的生长。
[0263]
(6)虽然两组试验中，1％剂量组的存活率最高，但生长性能并非最高，而是0.1％的剂量组。从治疗的实践来看，药物一定范围内的剂量加大可增加治病效果，但过高剂量的给药有时会影响宿主的生长，究其原因仍有待研究，可能是过高剂量对营养生长存在副作用。
[0264]
(7)抗感染实验结果显示，食用未含lae烟酸离子对饲料的试验鱼全部死亡，食用含有lae烟酸离子对的罗非鱼存活率分别为63.66％、80％、91.67％。说明添加0.01％
‑
1％lae离子对的确能够提升鱼的抗感染能力。
[0265]
考虑到生长周期以及lae烟酸离子对饲料添加剂的成本，因此lae烟酸离子对作为饲料添加剂的有效浓度为0.01
‑
1％、优选0.1
‑
1％、最优选0.1％时能有效防治发病，符合生产的需要。
[0266]
实施例十五、lae离子对与抗生素、lae对腹泻仔猪的治疗效果的比较
[0267]
申请人委托河南省某大型养猪场，对其农场的118头出现腹泻的仔猪进行给药sy(即lae)、lae离子对实验。
[0268]
另设置庆大霉素给药组作为平行对照。
[0269]
每天早(7:00)、中(12:00)、晚(18:00)3次，对病猪进行灌药。
[0270]
评价标准：腹泻治好后无需用药的动物，计为剩余存活的动物，即试验停止；
[0271]
仔猪用药后无效死亡的动物，计为死亡的动物，即试验停止。
[0272]
结果如表12所示。
[0273]
表12
[0274][0275]
如上表所示，使用庆大霉素治疗的仔猪，平均治愈率为77.5％。然而，该剂量已经远远超过常规抗生素的使用剂量，预示着为了获得该治愈率，仔猪体内的抗生素残留将显著超标。
[0276]
使用lae治疗的仔猪，最小剂量10mg/kg的治愈率为72.2％，最大剂量50mg/kg的治愈率为78.57％，均远远超过相同剂量的抗生素的治愈率(10mg/kg的庆大霉素的治愈率未显示)，这表明lae在治疗仔猪腹泻上，相比于庆大霉素，其相同给药剂量的治愈率更高，且
因其良好的生物代谢特性，将预示仔猪体内不存在任何有害药物的残留，为替代兽用抗生素提供了良好的方向。
[0277]
至于lae离子对在治疗腹泻仔猪的试验正在进行中。但根据实施例九至实施例十四中一致显示的lae离子对化合物在抗菌性优于lae化合物的试验结果，发明人可以预期lae离子对化合物在治疗腹泻仔猪的结果将优于lae化合物的治疗效果，这预示着lae离子对化合物同样能够取代抗生素而广泛用于农业生产中。