吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用。


背景技术：

2.瘢痕引起皮肤正常结构的改变，不仅影响外观，且瘢痕形成后导致的瘙痒、疼痛严重影响患者的生活质量。更有甚者，严重瘢痕引起关节挛缩，限制关节活动而导致畸形。临床上有大量的抗瘢痕药物，比如局部注射的曲安奈德等激素药物、积雪苷霜软膏、复方肝素钠尿囊素凝胶、硅酮膏等，但均存在疗效差、治疗时间长、价格昂贵、副作用大等缺陷。
3.瘢痕形成机制目前仍未十分明了。瘢痕中正常成纤维细胞细胞向肌成纤维细胞转化，进而大量增殖、抵抗凋亡、并分泌胶原等细胞外基质，被认为是瘢痕形成的主要机制。同时，肌成纤维细胞过量表达平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α
‑
sma)，能引起瘢痕挛缩。细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网架体系，包括微管、微丝及中间纤维，在维持细胞形态、承受外力、保持细胞正常增殖迁移收缩等功能方面起着重要作用。理论上，抑制瘢痕成纤维细胞的细胞骨架能改善瘢痕形成。
4.吴茱萸碱是传统中草药吴茱萸的最重要生物碱成分之一，以其多功能性而闻名，用于治疗呕吐、头痛、腹泻、腹痛等疾病，其提取容易且临床治疗安全性高。同时，吴茱萸碱在抗肿瘤中也发挥着重要作用，能抑制肿瘤细胞的细胞骨架形成，从而抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。但目前未见吴茱萸碱用于瘢痕治疗的报道。


技术实现要素：

5.本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用。
6.本发明提供了一种吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用。
7.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，瘢痕包括未成熟瘢痕、成熟瘢痕、萎缩性瘢痕、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩以及由肌成纤维细胞激活所引起的系统性皮肤硬化病。
8.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，药物为通过抑制瘢痕肌成纤维细胞细胞外基质的分泌来预防和/或治疗瘢痕的药物。
9.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，药物为通过抑制瘢痕成纤维细胞的增殖与迁移来预防和/或治疗瘢痕的药物。
10.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，药物为通过促进瘢痕成纤维细胞的凋亡来预防和/或治疗瘢痕的药物。
11.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，药物为通过抑制瘢痕成纤维细胞的细胞骨架的活性来预防和/或治疗瘢痕的药物。
12.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，瘢痕为哺乳动物的瘢痕。
13.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，哺乳动物为兔。
14.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，吴茱萸碱的使用浓度为10μm
‑
100μm。
15.在本发明提供的吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用中，还可以具有这样的特征：其中，吴茱萸的给药方式为瘢痕内局部注射。
16.发明的作用与效果
17.吴茱萸碱已被广泛研究，其对应的药理学、药代学、毒理学等研究较为完善，局部应用吴茱萸碱抗瘢痕安全、有效且价格低廉。
18.此外，吴茱萸碱通过抑制瘢痕肌成纤维细胞细胞外基质的分泌、抑制瘢痕成纤维细胞的增殖、促进瘢痕成纤维细胞的凋亡以及抑制瘢痕成纤维细胞的细胞骨架的活性来预防和/或治疗瘢痕。
19.另外，目前已上市的抗瘢痕药物曲安奈德、积雪苷霜、复方肝素钠尿囊素、硅酮凝胶等，主要通过引起瘢痕局部低氧、抑制局部炎症反应减轻瘢痕增生。而本发明中的吴茱萸碱与这些药物的作用机制不同，因此可以与这些药物协同使用而达到更好的预防和/或治疗瘢痕效果。
附图说明
20.图1是本发明的实施例一中吴茱萸碱诱导瘢痕成纤维细胞凋亡大体观图；
21.图2是本发明的实施例一中吴茱萸碱诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的流式结果图；
22.图3是本发明的实施例一中吴茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞增殖的结果图；
23.图4是本发明的实施例一中吴茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞细胞外基质分泌的结果图；
24.图5是本发明的实施例一中茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞的细胞骨架的结果图；
25.图6是本发明的实施例二中动物实验评估吴茱萸碱对瘢痕的抑制作用的结果图。
具体实施方式
26.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明吴茱萸碱在制备预防和/或治疗瘢痕的药物中的应用作具体阐述。
27.<实施例一>
28.本实施例为吴茱萸碱抑制瘢痕肌成纤维细胞生物学活性的体外实验研究。
29.1.1实验方法
30.(1)瘢痕成纤维细胞分离
31.患者同意并签署知情同意书，术中获取增生性瘢痕组织，反复pbs清洗后，剪成1cm
左右大小的组织块，dispase酶4℃消化过夜后剥去表皮，真皮部分使用0.2％胶原蛋白酶消化约1小时，悬液采用200目滤网过滤后收集离心，完全培养基重悬培养，使用第2
‑
3代细胞进行下一步实验。
32.(2)cck
‑
8法检测瘢痕成纤维细胞增殖
33.细胞铺板于96孔板(约8000个细胞/孔)，完全培养基中培养12小时后加入不同浓度药物。实验分四组：0μm吴茱萸碱组、0.05μm吴茱萸碱组、0.25μm吴茱萸碱组、1.25μm吴茱萸碱组。检测细胞增殖时每孔加入10μl cck
‑
8试剂，避光孵育培养3小时后使用酶标仪检测每孔在450nm吸光度下的od值。
34.(3)annexinv/pi流式细胞术检测细胞凋亡与周期
35.细胞铺板于96孔板(约5
×
105个细胞/孔)，完全培养基中培养12小时后加入不同浓度药物。实验分四组：0μm吴茱萸碱组、0.05μm吴茱萸碱组、0.25μm吴茱萸碱组、1.25μm吴茱萸碱组。继续培养24小时后消化细胞为单细胞悬液，采用100μl缓冲液重悬细胞。检测细胞凋亡时，加5μlfitc
‑
annexinv和10μl碘化丙啶(pi)室温孵育10分钟后上机，采用beckman流式细胞仪检测凋亡细胞比例；检测细胞增殖时，加500μl dna染色液和5μl细胞穿膜液，孵育30分钟后上机检测。
36.(4)细胞外基质表达检测
37.细胞铺板于96孔板(约5
×
105个细胞/孔)，待细胞融合至70％
‑
80％后加入不同浓度药物。实验分四组：0μm吴茱萸碱组、0.05μm吴茱萸碱组、0.25μm吴茱萸碱组、1.25μm吴茱萸碱组。24小时后采用western
‑
blot检测i型胶原(collagen i)、iii型胶原(collagen iii)及平滑肌肌动蛋白(α
‑
sma)的表达。具体步骤：6孔板每孔加100
‑
150μl蛋白裂解液，20分钟后4℃、12000g条件下离心15分钟，蛋白煮沸5分钟后上样。电泳、转膜后5％脱脂奶粉室温封闭一小时，分别加入相应的一抗，4℃孵育过夜后加入对应的二抗，最后使用辣根过氧化物酶hrp
‑
ecl发光法显色。
38.1.2统计分析
39.统计分析采用软件spss 20.0，计数资料的多组数据之间的比较采用anova分析，两组数据之间的比较采用t检验，p<0.05认为差异有统计学意义。
40.1.3实验结果
41.图1是本发明的实施例一中吴茱萸碱诱导瘢痕成纤维细胞凋亡大体观图；图2是本发明的实施例一中吴茱萸碱诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的流式结果图；图3是本发明的实施例一中吴茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞增殖的结果图；图4是本发明的实施例一中吴茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞细胞外基质分泌的结果图；图5是本发明的实施例一中茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞的细胞骨架的结果图。
42.如图1
‑
5所示，不同浓度吴茱萸碱作用24小时后可见瘢痕成纤维细胞大量凋亡，细胞为圆形、透亮、甚至漂浮，且随药物浓度增加作用逐渐增强，浓度越大细胞凋亡越多(图1)。annexin v/pi流式细胞术检测进一步佐证了大体观的细胞凋亡结果，可见吴茱萸碱对瘢痕成纤维细胞的作用呈浓度依赖性，浓度越高细胞凋亡更明显(图2)。cck
‑
8试验检测细胞增殖，发现最低浓度(0.05μm)吴茱萸碱对瘢痕成纤维细胞的细胞增殖即有明显抑制作用，在药物作用24小时后与对照组比有统计学差异，且时间越长这种差异越明显(图3a)。进一步，流式细胞术检测细胞周期，发现吴茱萸碱抑制细胞在g2/m期，且随浓度增加抑制效果
更明显(图3b
‑
c)。我们采用western blot检测不同浓度吴茱萸碱对瘢痕成纤维细胞的细胞外基质分泌的影响，结果显示吴茱萸碱能抑制i型胶原(collagen i)、iii型胶原(collagen iii)及平滑肌肌动蛋白(α
‑
sma)的表达，这种抑制作用呈浓度依赖性，药物浓度越大抑制作用更明显(图4)。为探究吴茱萸碱抑制瘢痕成纤维细胞生物学活性的作用机制，我们进一步检测细胞微管微丝的排列。α
‑
微管蛋白(α
‑
tubulin)免疫荧光结果显示对照组瘢痕成纤维细胞的微管网络排列正常，从细胞核向细胞外周均匀延伸；经吴茱萸碱作用24小时后，细胞质中微管聚集在细胞核周围，细胞的形态由长梭形变为钝而不规则形状(图5a)。鬼笔环肽(phalloidin)免疫荧光特异染色f
‑
肌动蛋白，发现吴茱萸碱处理后微丝明显紊乱、缩短，细胞形态也明显改变(图5b)。
43.<实施例二>
44.本实施例为动物实验评估吴茱萸碱对瘢痕的抑制作用。
45.2.1兔耳瘢痕模型建立
46.8只雄性新西兰兔购买于海军军医大学实验动物中心，大小2
‑
3个月，体重2.0kg
‑
2.5kg。采用舒泰耳缘静脉注射麻醉成功后，75％酒精消毒，每只兔耳腹侧制备6个直径1cm的圆形全层皮肤缺损创面，仔细分离去除全层皮肤、皮下组织及软骨膜。术后给与镇静镇痛药物，每日观察创面直至术后3周创面完全上皮化。
47.2.2实验分组
48.8只新西兰兔随机分为2组：实验组为吴茱萸碱瘢痕内局部注射，药物浓度50μm，每个创面100μl，3天注射一次，共注射6次；对照组为每个创面局部注射100μlpbs，3天注射一次，共注射6次。
49.2.3实验评估
50.(1)瘢痕大体观
51.术后每周拍照观察瘢痕硬度、色泽、柔软度。
52.(3)组织学检测
53.术后第39天取材，将每个瘢痕组织分为2份，一份用于western blot检测collagen i、collagen iii及α
‑
sma的表达(实验方法同实例1)，一份采用4％多聚甲醛固定后石蜡包埋，组织切片常规行h&e染色和masson染色观察瘢痕组织中胶原形成情况。
54.2.4统计分析
55.统计分析采用软件spss 20.0，计数资料的多组数据之间的比较采用anova分析，两组数据之间的比较采用t检验，p<0.05认为差异有统计学意义。
56.2.5实验结果
57.图6是本发明的实施例二中动物实验评估吴茱萸碱对瘢痕的抑制作用的结果图。
58.如图6所示，在术后3周创面完全上皮化，术后第39天可见对照组瘢痕厚且硬，颜色深红并凸出皮面；吴茱萸碱给药组瘢痕无论从硬度、厚度、颜色等方面都较对照组明显改善(图6a)。h&e染色计算瘢痕厚度值，可见吴茱萸碱给药组瘢痕厚度明显降低(图6b)。进一步，masson染色发现吴茱萸碱给药组胶原纤维排列整齐、稀疏，而对照组胶原纤维排列致密而紊乱(图6c)。最后，westernblot检测瘢痕组织中collagen i、collagen iii及α
‑
sma的表达，可见吴茱萸碱给药组中各指标均明显降低，与对照组相比差异具有统计学意义(图6d)。
59.实施例的作用与效果
60.通过实施例一和实施例二的实验结果证明，吴茱萸碱确实可以通过抑制瘢痕肌成纤维细胞细胞外基质的分泌、抑制瘢痕成纤维细胞的增殖、促进瘢痕成纤维细胞的凋亡以及抑制瘢痕成纤维细胞的细胞骨架的活性来预防和/或治疗瘢痕。
61.上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。