一种具有多齿配位结构的组氨酸/L-半胱氨酸双功能化石墨烯量子点铜基类漆酶纳米酶、其制备方法及其在甲萘威比色检测中的应用

本发明属于纳米酶材料制备及农药分析检测，具体涉及一种具有多齿配位结构的组氨酸/l-半胱氨酸双功能化石墨烯量子点铜基类漆酶纳米酶、其制备方法及其在甲萘威比色检测中的应用。

背景技术：

1、甲萘威是一种高效、广谱的氨基甲酸酯类杀虫剂，广泛应用于农业生产中的病虫害防治。然而，甲萘威的过度使用导致其在农产品及环境水体中残留，对人体健康构成潜在威胁。因此，建立快速、灵敏、简便的甲萘威残留检测方法具有重要意义。目前，甲萘威的检测主要依赖高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等分析方法，这些方法虽然准确可靠，但存在操作繁琐、依赖大型仪器、成本高昂、难以满足现场快速检测需求等局限性。比色法因其操作简便、无需复杂设备、结果直观等优势，已成为农药残留快速检测领域的研究热点。

2、天然漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能够以氧气为电子受体催化酚类底物的氧化反应。然而，天然漆酶在实际应用中存在稳定性差、易失活、成本高昂、重复利用性低等固有缺陷，严重制约了其大规模推广应用。纳米酶是一类具有酶催化活性的纳米材料，因其低成本、高稳定性、易于规模化制备等优势，成为替代天然酶的研究热点。近年来，通过铜离子与有机配体配位构建具有类漆酶活性的纳米酶，因其合成方法灵活、尺度可控等优点而受到广泛关注。

3、目前，以铜离子与有机配体配位制备类漆酶纳米酶的方法已有报道。以含咪唑基的有机小分子（如2-甲基苯并咪唑、2-甲基咪唑）与铜离子配位，是构建类漆酶纳米酶的常用策略之一，咪唑基上的氮原子可作为配位原子与铜离子配位。然而，小分子配体的配位位点种类单一，缺乏多齿协同配位效应，难以有效模拟天然漆酶活性中心中多种氨基酸残基协同配位铜离子的复杂结构，且缺乏载体支撑，纳米颗粒易团聚，导致催化活性偏低。在此基础上，含有多个配位基团的二肽分子（如半胱氨酸-组氨酸二肽）被用于与铜离子配位，半胱氨酸残基上的巯基和组氨酸残基上的咪唑基均可参与铜离子的配位，形成更为丰富的配位结构。然而，该方法仍存在以下不足：二肽分子的合成成本较高，且两个氨基酸通过肽键连接后，其分子构象和配位基团的空间排布相对固定，配位结构的可调控性受限；制备过程中使用有机溶剂，不符合绿色化学的发展理念。碳纳米材料（石墨烯量子点、碳量子点等）也被用作载体负载铜离子，一方面可利用碳材料的高比表面积提高铜离子的分散度，另一方面碳材料表面的官能团可增加铜离子的负载量。其中，石墨烯量子点是碳材料家族的新兴成员，具有优异的电子供体和受体性能，通过功能化使其边缘含有丰富的功能性基团（羧基、氨基、羟基等），为铜离子的锚定提供了潜在的结合位点。然而，现有碳材料负载铜的方法中，铜离子主要通过物理掺杂或单齿配位方式负载于碳材料表面，缺乏多齿协同配位结构，铜离子的结合位点有限且分散不均匀，铜离子与载体之间的结合力较弱，在使用过程中易脱落，导致催化活性下降和重复使用性差。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有多齿配位结构的组氨酸/l-半胱氨酸双功能化石墨烯量子点铜基类漆酶纳米酶、其制备方法及其在甲萘威比色检测中的应用。本发明旨在开发一种以石墨烯量子点为载体、通过双氨基酸协同功能化构筑多齿配体体系、在水相温和条件下与铜离子配位的高活性类漆酶纳米酶，并将其应用于农药残留的比色检测。

2、本发明解决技术问题的技术方案具体如下：

3、在本发明的第一方面，提供了一种具有多齿配位结构的组氨酸/l-半胱氨酸双功能化石墨烯量子点铜基类漆酶纳米酶，又称cu-his-cys-gqds纳米酶，其采用如下方法制备而成：

4、1）将组氨酸、l-半胱氨酸和柠檬酸按摩尔比1:0.2-0.4:1混合溶于水中，经热解反应，获得组氨酸/l-半胱氨酸双功能化石墨烯量子点his-cys-gqds；

5、2）将步骤1）所得his-cys-gqds分散于去离子水中，调节ph至中性，在持续搅拌下，缓慢加入cu(no3)2·3h2o溶液，使铜离子与his-cys-gqds表面的多齿配体发生配位反应，得到cu-his-cys-gqds纳米酶，其中，cu2+与his-cys-gqds的质量比为1.5-4:1。这里cu2+的质量指的是铜元素的质量。

6、进一步地，所述的步骤1）中，组氨酸、l-半胱氨酸和柠檬酸的摩尔比为1:0.2:1。

7、进一步地，所述的步骤1）中，热解反应的温度为180℃，时间为3 h。

8、进一步地，所述的步骤2）中，配位反应的时间为15分钟。

9、进一步地，所述的步骤2）中，cu2+与his-cys-gqds的质量比为2.5:1。

10、在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述cu-his-cys-gqds纳米酶在农药甲萘威比色检测中的应用。

11、在本发明的第三方面，提供了一种甲萘威的比色检测方法，所述方法基于如第一方面所述cu-his-cys-gqds纳米酶建立，包括以下步骤：

12、1）配制一系列不同浓度的甲萘威标准溶液，浓度范围为0.5～90 μm，将甲萘威在碱性条件下（ph=10.0）进行水解处理，水解时间为25-30分钟，待水解完全后，将所得水解产物与4-氨基安替比林（4-aap）在缓冲液（30 mm，ph=10.0）中混合均匀，随后加入cu-his-cys-gqds纳米酶分散液，构建反应体系，将各反应体系置于50℃恒温水浴中孵育反应28分钟；由纳米酶催化水解产物氧化并与4-aap发生偶联反应，生成红色醌亚胺产物；

13、2）反应结束后，将各反应体系进行离心分离，取上清液，采用紫外-可见分光光度计测定各上清液在400～700 nm波长范围内的吸收光谱，记录510 nm波长处的吸光度值，以甲萘威标准溶液浓度为横坐标，以510 nm处吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并建立线性回归方程；

14、3）将待测样品按照与步骤1）相同的条件进行水解、显色反应和光谱测定，将测得的吸光度代入步骤2）所得线性回归方程，计算待测样品中的甲萘威含量。

15、本发明具有如下技术效果：

16、1）本发明通过在石墨烯量子点表面进行组氨酸和l-半胱氨酸双重功能化，构筑了含有咪唑基、巯基、氨基和羧基的多齿配体体系，通过协同配位高效锚定铜离子，形成稳定的多齿螯合结构，显著提高了铜离子的负载量、分散性和配位稳定性。所得cu-his-cys-gqds表现出优异的类漆酶活性，其稳态动力学参数如下：km = 0.14 mm，vmax =33.74 μmmin-1。

17、2）本发明采用“一步热解法”同步实现石墨烯量子点的合成与双氨基酸的原位功能化，较现有后修饰多步工艺大幅缩短制备周期、降低成本；铜离子配位反应在室温水相中进行，无需高温高压、无需复杂设备、不涉及有毒有机溶剂，原料易得，适合规模化生产。

18、3）本发明利用cu-his-cys-gqds纳米酶催化甲萘威水解产物氧化并与4-氨基安替比林偶联显色的原理，建立了甲萘威比色检测新方法。该方法在510 nm处产生特征吸收峰，吸光度与甲萘威浓度（0.5～90 μm）呈线性关系，检测限低至0.22 μm；检测过程无需大型仪器，操作简便，适合现场快速检测。