具有双重吸附作用的琼脂糖微球吸附剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及血液净化，具体涉及一种具有双重吸附作用的琼脂糖微球吸附剂及其制备方法，该吸附剂可同时吸附血液中的内毒素（lps）和促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α，tnf-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，il-6）），可应用于脓毒症等重症的血液净化治疗。

背景技术：

1、脓毒症（sepsis）是感染引发的宿主免疫失调所致的危及生命的器官功能障碍，也是重症监护室（icu）最常见的危重症之一，具有高发病率、高死亡率的特点，被视为危重症领域的“头号杀手”。

2、现有技术多通过在基材表面修饰亲和配基实现lps或细胞因子的吸附清除。例如，cn113351185a公开了一种以聚苯乙烯-二乙烯基苯微球为载体、通过分子臂连接多粘菌素b的血液灌流微球吸附剂，其对胆红素和lps具有较好的吸附性能，但无法清除促炎细胞因子；cn1864755a公开了一种以琼脂糖凝胶为基质、经环氧氯丙烷和己二胺活化后键合多粘菌素b配基的lps吸附剂，同样仅针对lps单一靶标；cn104525151a公开了一种以聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸甲酯多孔树脂为载体的lps吸附剂，其通过对载体残余双键进行环氧化改性后固载聚赖氨酸、聚乙烯亚胺（pei）等配基，并借助对孔径和比表面积的控制兼顾部分细胞因子的吸附；cn113509919a公开了一种以纳米碳酸钙-苯乙烯-二乙烯苯为骨架、接枝多胺基氨基酸或多肽配基的介孔吸附剂，可同时清除lps及tnf-α、il-6等炎症因子。

3、然而，上述能够实现双重吸附的材料均以聚苯乙烯等强疏水性高分子为基材，疏水基材与血浆蛋白之间的非特异性疏水相互作用强，血液相容性差，易造成总蛋白、血小板大量下降，引发凝血等不良反应，临床应用风险较高；而以壳聚糖、聚醚砜、纤维素、二氧化硅等基材修饰重组多肽、聚阳离子电解质、组氨酸等配基的吸附材料，则普遍仅能实现lps的单一清除，无法同时清除促炎细胞因子。

4、琼脂糖是从红藻中提取的天然中性多糖，亲水性强、生物相容性优良、无毒且不易激活补体系统，其分子链上富含羟基，易于通过化学改性引入功能基团，是构建血液净化吸附材料的理想基材。但天然琼脂糖凝胶机械强度低、耐压性能差，直接用作血液灌流吸附剂时在灌流压力下易变形、破碎，须经共价交联增强后方可满足使用要求；且如何在亲水性多糖骨架上同时构建分别针对lps（静电与疏水协同作用）和促炎细胞因子（疏水作用）的吸附位点，并使修饰后的材料维持较低的总蛋白非特异性吸附和良好的血液相容性，现有技术中尚无成熟的解决方案。

5、因此，急需开发一种能够同时高效清除血液中lps与促炎细胞因子、总蛋白非特异性吸附低、血液相容性好的血液净化吸附剂。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服以上所述的缺点，提供一种具有lps与促炎细胞因子双重吸附作用的琼脂糖微球吸附剂，该吸附剂可同时高效清除血液中的lps和促炎细胞因子，且总蛋白非特异性吸附低、血液相容性好；本发明同时提供该吸附剂的制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明的具体方案如下：

3、本发明第一方面提供了一种具有双重吸附作用的琼脂糖微球吸附剂，包括经共价交联的琼脂糖微球基体，所述琼脂糖微球基体的多糖骨架羟基上共价接枝有疏水基团，所述琼脂糖微球基体的多糖骨架上还共价接枝有含多胺基的阳离子大分子；所述疏水基团不接枝于所述阳离子大分子，所述吸附剂可同时吸附血液中的lps和促炎细胞因子。

4、优选地，所述疏水基团通过醚键或酯键与琼脂糖多糖骨架的羟基连接。

5、优选地，通过醚键连接的所述疏水基团为苯基、c4-c12烷基中的至少一种；通过酯键连接的所述疏水基团为c6-c12酰基中的至少一种。

6、优选地，所述含多胺基的阳离子大分子选自pei、聚赖氨酸中的至少一种。

7、优选地，所述吸附剂的胺基密度为每毫升湿微球150-250 μmol；所述疏水基团的接枝取代度为每克交联琼脂糖干基0.5-3.0 mmol，更优为1.0-2.0 mmol/g。

8、本发明第二方面提供了一种上述琼脂糖微球吸附剂的制备方法，按顺序包括如下步骤：

9、a1、将琼脂糖配制成质量浓度4%-8%的水溶液，加热溶解后加入油相乳化分散，降温固化成球，再经环氧氯丙烷共价交联，得到交联琼脂糖微球基球；

10、a2、将步骤a1得到的交联琼脂糖微球基球与疏水化试剂反应，使疏水基团共价接枝到琼脂糖多糖骨架的羟基上，得到疏水改性微球；

11、a3、先对步骤a2得到的疏水改性微球进行环氧活化，再与含多胺基的阳离子大分子发生接枝反应，得到所述琼脂糖微球吸附剂。

12、优选地，步骤a2中所述疏水化试剂为丁基缩水甘油醚、辛基缩水甘油醚或苯基缩水甘油醚时，反应采用水与二甲基亚砜（dmso）的混合溶剂，以氢氧化钠为催化剂，反应温度30-60℃，反应时间8-16小时；反应完成后用水、乙醇交替洗涤至中性。

13、优选地，步骤a2中所述疏水化试剂为碳链长度6-12的酰氯时，反应采用吡啶、甲苯或四氢呋喃为溶剂，加入三乙胺作为缚酸剂；反应完成后依次用吡啶、乙醇、水洗涤。

14、本发明第三方面提供了上述琼脂糖微球吸附剂在制备血液净化吸附材料中的应用；所述血液净化吸附材料用于清除血液中的lps和促炎细胞因子，可用于脓毒症患者的血液净化治疗。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、本发明通过在琼脂糖微球骨架上分别引入疏水基团和多胺基阳离子大分子，可同时吸附血液中的lps以及il-6、tnf-α等促炎细胞因子；其中在胺基密度和疏水取代度优选范围内（胺基密度≥170 μmol/ml、疏水取代度≥1.0 mmol/g），促炎细胞因子吸附能力与中国健帆ca相当，lps吸附优势明显，远高于美国百特oxiris滤器20%-30%的吸附水平。需要说明的是，oxiris为滤过型血液净化产品，与本发明吸附型产品的工作原理不同，此处lps吸附率对比仅用于说明本发明在lps清除方面的性能优势。

17、本发明以天然亲水性琼脂糖为基材，相比聚苯乙烯类强疏水基材，对血浆蛋白的非特异性吸附显著降低，总蛋白下降率低于10%，低于中国健帆ca的13%，可有效减少治疗过程中血液正常成分的流失。

18、本发明接枝的多胺基阳离子大分子带有大量正电荷，可通过静电作用吸附带负电的肝素；临床使用前经肝素预冲后，微球表面可结合一层稳定的肝素层，有效延长活化部分凝血活酶时间（aptt），具有良好的抗凝性能，可降低血液净化过程中的凝血风险。

1.一种具有双重吸附作用的琼脂糖微球吸附剂，其特征在于，包括经共价交联的琼脂糖微球基体，所述琼脂糖微球基体的多糖骨架羟基上共价接枝有疏水基团，所述琼脂糖微球基体的多糖骨架上还共价接枝有含多胺基的阳离子大分子；所述疏水基团不接枝于所述阳离子大分子，所述吸附剂可同时吸附血液中的内毒素和促炎细胞因子。

2.根据权利要求1所述的琼脂糖微球吸附剂，其特征在于，所述疏水基团通过醚键或酯键与琼脂糖多糖骨架的羟基连接。

3.根据权利要求2所述的琼脂糖微球吸附剂，其特征在于，通过醚键连接的所述疏水基团为苯基、c4-c12烷基中的至少一种；通过酯键连接的所述疏水基团为c6-c12酰基中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的琼脂糖微球吸附剂，其特征在于，所述含多胺基的阳离子大分子选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的琼脂糖微球吸附剂，其特征在于，所述吸附剂的胺基密度为每毫升湿微球150-250 μmol；所述疏水基团的接枝取代度为每克交联琼脂糖干基0.5-3.0mmol。

6.一种如权利要求1至5中任一项所述琼脂糖微球吸附剂的制备方法，其特征在于，按顺序包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a2中所述疏水化试剂为丁基缩水甘油醚、辛基缩水甘油醚或苯基缩水甘油醚时，反应采用水与二甲基亚砜的混合溶剂，以氢氧化钠为催化剂，反应温度30-60℃，反应时间8-16小时；反应完成后用水、乙醇交替洗涤至中性。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a2中所述疏水化试剂为碳链长度6-12的酰氯时，反应采用吡啶、甲苯或四氢呋喃为溶剂，加入三乙胺作为缚酸剂；反应完成后依次用吡啶、乙醇、水洗涤。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a1中所述环氧氯丙烷共价交联的条件为：将固化微球分散于1-2 mol/l氢氧化钠溶液中，按每克琼脂糖干基加入环氧氯丙烷0.5-1.5 ml，于40-70℃反应4-16小时；所得交联基球以纯水为介质的体积溶胀比为3-8。

10.权利要求1至5中任一项所述的琼脂糖微球吸附剂在制备血液净化吸附材料中的应用；所述血液净化吸附材料用于清除血液中的内毒素和促炎细胞因子，可用于脓毒症患者的血液净化治疗。