基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法

本发明属于生物传感，具体涉及一种基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法。

背景技术：

1、尿酸（uric acid, ua）是人体内嘌呤代谢的终产物。在正常生理状态下，人尿液中ua浓度维持在为1400~4400 μmol/l，其生成与排泄处于动态平衡。然而，饮食结构调整、生活模式改变等因素可能导致ua生成增多，引发血尿酸水平持续性升高，进而造成高尿酸血症（hyperuricemia, hua）。hua与高血压、心脑血管疾病及代谢综合征等密切相关，已成为全球关切的公共卫生问题，精准监测尿酸水平对hua及其关联疾病的诊断与管理具有重要意义。

2、目前，体液中ua的检测方法主要包括色谱法、电化学法、酶介导比色分析法等。其中，色谱技术虽能提供较高准确度，却繁琐、费时且高度依赖高精密的仪器设备；电化学分析虽灵敏度优异，却存在重现性不足的局限；以天然尿酸酶等驱动的比色分析法虽具备可视化及无需高端设备等优势，但天然尿酸酶对反应条件要求苛刻、易失活且造价高昂，制约了其实际推广。因此，仍需研发便捷、高效、稳定、经济的尿酸定量分析方法。

3、纳米酶是一类能够模拟天然酶催化行为的功能纳米材料，因稳定性高、合成简便、成本低和催化性能可调控等优势，被视为天然酶的理想替代，在分析检测领域有广泛应用。专利文献cn114935572a公开了一种基于纳米材料的可视化尿酸检测方法。该检测技术利用尿酸的还原性，以表面带正电荷的金纳米颗粒作为过氧化物酶，3,3 ',5 ,5 '四甲基联苯胺（tmb）为显色剂，根据显色强度对尿酸含量进行快速检测分析。该检测方法利用表面带正电荷的金纳米颗粒的类过氧化物酶效应，可以实现可视化无酶尿酸检测。

4、专利文献cn116413235a公开了一种用于监测尿酸和尿酸氧化酶变化的可视化定量分析方法。该方法首先将pd2+掺杂在纳米材料制备pd2+/agauagi纳米酶以改善其电子转移速率及提高催化剂的催化效率，能够催化还原h2o2分解释放·oh，·oh进一步氧化显色底物tmb，紫外吸收增加，底物产生无色到蓝色的变化，实现h2o2的可视化响应。其次利用uox能

5、够催化ua生成h2o2，通过分别固定uox或ua浓度，以h2o2的吸光度值作为信号输出，实现对ua和uox的可视化定量分析。基于此，构建了一种分析快速、操作简便、成本低的h2o2、ua和uox可视化定量检测方法。

6、多酚是一类广泛存在于自然界的植物次生代谢产物，大多数植物多酚可与金属离子发生多元化互作，以简单、快速、稳定的方式组装形成金属-多酚网络（metal-phenolicnetworks, mpns）。mpns兼具多酚与金属双重属性，可衍生多种功能，在生物医学、药物递送和组织工程等领域有广泛应用。尤值得注意的是，金属配位作用有望赋予mpns类酶催化活性，为衍生构建新型纳米酶及其传感检测平台构建提供了可能。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种金属-多酚网络纳米酶新的催化剂，基于金属-多酚网络纳米酶建立一种尿酸（ua）定量分析方法。本发明通过溶剂热-金属配位法合成了具有类过氧化物酶活性的香草酸-铁过氧化物纳米酶（va-fe），以香草酸（vanillic acid, va）为前驱体交联硝酸铁（fe(no3)3·9h2o）合成了va-fe，通过考察反应条件对va-fe催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）-过氧化氢（h2o2）反应的影响，建立了ua的比色传感检测方法。本发明提供的基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法具有准确度高、灵敏性好、操作简便等优势，不仅拓展了金属-多酚网络纳米酶的应用领域，也为ua监测提供了新的策略。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、本发明提供了一种香草酸-铁过氧化物纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤s1、将香草酸溶解于乙醇水溶液中，接着滴加氨水和糠醛，混合均匀后，在温度为150~170 ℃的条件下反应6~8 h，得反应液i；

5、步骤s2、将步骤s1制得的反应液i冷却至室温，接着边搅拌边滴加fe(no3)3·9h2o溶液，充分交联20~28 h后，在温度为90~100 ℃的条件下反应10~15 h，得反应液ii；

6、步骤s3、将步骤s2制得的反应液ii冷却至室温，离心，收集沉淀，洗涤，干燥，即得。

7、进一步地，所述步骤s1中香草酸与乙醇水溶液的料液比为0.01 g：3 ml，所述乙醇水溶液由无水乙醇与水按体积比1:2混合组成。

8、进一步地，所述步骤s1中香草酸与氨水的料液比为0.3 g：1 ml，所述氨水的浓度为25~27 wt%。

9、进一步地，所述步骤s1中香草酸与糠醛的料液比为0.2 g：1 ml。

10、进一步地，所述步骤s2中香草酸与fe(no3)3·9h2o溶液的料液比为0.03 g：1 ml，所述fe(no3)3·9h2o溶液的浓度为10~18 mg/ml。

11、进一步地，所述步骤s3的离心条件为：在转速为9000~12000 r/min的条件下离心4~6 min，所述干燥条件为：在温度为55~65 ℃的条件下干燥10~15 h。

12、进一步地，本发明还请求保护所述香草酸-铁过氧化物纳米酶的制备方法制得的香草酸-铁过氧化物纳米酶。

13、另外，本发明还请求保护所述香草酸-铁过氧化物纳米酶在尿酸定量分析中的应用。

14、进一步地，本发明还提供了一种基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法，所述基于香草酸-铁过氧化物纳米酶建立的尿酸比色检测体系，终浓度组成为：125~1000 μg/ml上述香草酸-铁过氧化物纳米酶溶液，1~20 mmol/l 3,3',5,5'四甲基联苯胺溶液，1~100 mmol/l h2o2溶液，不同浓度尿酸，ph 2.0~6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在15~55 ℃恒温下孵育8~12 min，检测652 nm处吸光值，根据尿酸标准品浓度与吸光值的标准曲线计算尿酸浓度。

15、进一步地，500 μg/ml上述香草酸-铁过氧化物纳米酶溶液，10 mmol/l 3,3',5,5'四甲基联苯胺溶液，50 mmol/l h2o2溶液，不同浓度尿酸，ph 3.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在35 ℃恒温下孵育10 min，检测652 nm处吸光值，根据尿酸标准品浓度与吸光值的标准曲线计算尿酸浓度。

16、具体地，本发明提供的基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法，包括以下步骤：

17、步骤a、标准曲线建立：在96孔酶标板中，依次加入20 μl（500 μg/ml）va-fe溶液、20 μl tmb溶液（10 mmol/l）、20 μl h2o2溶液（50 mmol/l）、20 μl不同浓度的尿酸溶液和120 μl hac-naac缓冲液，充分混匀，在35 ℃恒温下孵育10 min后测量记录溶液652 nm处的吸光值并建立标准曲线。

18、步骤b、实际样品检测：收集健康成年志愿者的尿液样品用水稀释10倍，在96孔酶标板中，依次加入20 μl（500 μg/ml）va-fe溶液、20 μl tmb溶液（10 mmol/l）、20 μl h2o2溶液（50 mmol/l）、20 μl稀释尿样和120 μl hac-naac缓冲液，充分混匀，在35 ℃恒温下孵育10 min后，测量并记录样品溶液652 nm处的吸光值，对照标准曲线计算样品尿酸浓度。

19、本发明以天然植物多酚香草酸（vanillic acid, va）和金属铁离子（fe(no3)3·9h2o）为主要原料，通过溶剂热-金属配位法合成了具有类过氧化物酶活性的香草酸-铁过氧化物纳米酶（va-fe），以香草酸（vanillic acid, va）为前驱体交联硝酸铁（fe(no3)3·9h2o）合成了va-fe，利用扫描电镜、红外光谱和x射线光电子能谱等方法对其形貌、结构、元素价态等进行了表征，考察了反应条件对va-fe催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）-过氧化氢（h2o2）反应的影响，并进行了催化机理和拟酶动力学分析，最后基于ua对反应的抑制建立了其比色传感检测方法。

20、结果表明：通过溶剂热-配位反应成功合成了微球形貌va-fe，平均粒径约526.4nm，va与铁离子配位形成金属-多酚网络，铁离子2p轨道存在多重分裂，主要以高自旋氧化态fe3+形式存在。va-fe表现出优异的类过氧化物酶活性，可催化h2o2产生超氧阴离子，并进一步氧化tmb生成蓝色氧化态tmb（oxtmb），催化反应遵循典型的michaelis-menten动力学模型。ua通过竞争性消耗自由基抑制oxtmb生成，使得体系蓝色褪去，在10~50 μmol/l ua浓度范围内，反应体系的吸光值（uv652 nm）与ua浓度呈良好的线性关系，据此构建了ua的便捷检测方法。

21、本发明提供的基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法的检出限为3.5 μmol/l，真实尿样中ua检测回收率为97.4%~104.6%，相对偏差（rsd）小于2%，液相分析验证了方法的准确性。该方法具有简便、灵敏、准确和响应快速等优势，为尿酸检测提供了新的技术参考，不仅研究拓展了金属-多酚网络纳米酶的应用范畴，也为尿酸监测提供了备选策略。

22、与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：

23、（1）本发明提供的香草酸-铁过氧化物纳米酶的制备方法制得的香草酸-铁过氧化物纳米酶表现出优异的类过氧化物酶活性，对底物有较好的亲和力和较优的催化转化效率，同时还具有较好的热稳定性，可以作为类过氧化物酶应用于尿酸的定量分析。

24、（2）本发明提供的基于香草酸-铁过氧化物纳米酶的尿酸比色传感检测方法具有准确度高、灵敏性好、操作简便等优势，为尿酸精准监测提供了新的替代方案。