一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统及方法

本发明涉及显微观测，尤其涉及一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统。

背景技术：

1、目前显微成像与光镊操控设备普遍采用分离式光路结构，扩展焦深显微成像与光学粒子捕获功能单独布设专属光路，成像系统与光镊控制系统为完全独立的运行单元。常规多焦点图像融合算法统一以标准点扩散函数模型为基础搭建运算框架，成像光路与光镊监测光路缺少集成化协同设计，两类光学信号全程采用独立采集传输模式，不存在统一的分光分离与分通道探测处理结构。

2、分离式光学布局会造成整体系统结构冗余，光学器件搭配复杂，光路校准与调试步骤繁杂，无法在同一观测视野区域内同步开展样品显微成像与微粒光镊捕获操作。固定化的原生焦深参数，压缩显微观测的纵向覆盖范围，难以完整采集样品多层立体结构的连续光学信息。标准点扩散函数模型无法适配扩展焦深特殊工况下的光学传输规律，造成图像融合处理后样品三维结构还原效果不足。不同光路的探测数据相互割裂隔绝，难以同步获取粒子运动受力参数与样品微观结构信息，无法完成捕获粒子和样品结构的空间关联分析。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种结合光镊功能的扩展焦深显微成像系统，包括：

3、光束生成与合束模块，生成一束具有相位调制的扩展焦深照明光束和一束具有特定空间形态的光镊操控光束，将所述扩展焦深照明光束与所述光镊操控光束进行空间同轴合束，形成组合光束；

4、信号采集模块，将所述组合光束导入显微物镜，聚焦于样品所在区域，

5、并收集穿过所述样品或被所述样品散射的光信号；

6、信号分离模块，对收集到的所述光信号进行分光与分离处理，将成像光路信号与光镊监测光路信号分离至不同的探测通道；

7、图像重建模块，在成像探测通道，利用改进的多焦点图像融合算法处理所述成像光路信号，所述改进的多焦点图像融合算法依据景深扩展后的点扩散函数模型进行优化，重建出样品的三维结构图像；

8、光镊分析模块，在光镊监测通道，分析所述光镊监测光路信号，计算被捕获粒子的三维位置、捕获刚度及所受光学力，基于重建出的所述样品的三维结构图像与计算得到的所述被捕获粒子的三维位置，在三维空间中可视化呈现粒子与样品结构的相对关系。

9、作为本发明的进一步方案，所述生成一束具有相位调制的扩展焦深照明光束和一束具有特定空间形态的光镊操控光束，将所述扩展焦深照明光束与所述光镊操控光束进行空间同轴合束，形成组合光束，包括：

10、从光源出射的原始光束经过偏振控制器件，形成两束偏振态正交的线偏振光；

11、其中一束线偏振光入射至第一空间光调制器，所述第一空间光调制器加载有计算全息图，所述计算全息图经过优化设计以产生具有环形强度分布或贝塞尔光束形态的波前，从而生成所述光镊操控光束；

12、另一束线偏振光入射至第二空间光调制器，所述第二空间光调制器加载有相位调制图案，所述相位调制图案用于对入射波前进行编码，以产生沿光轴方向具有扩展聚焦范围的照明光束，即所述扩展焦深照明光束；

13、将经过所述第一空间光调制器调制的光镊操控光束与经过所述第二空间光调制器调制的扩展焦深照明光束，通过偏振分光棱镜进行组合，使两束光束沿同一光路传播，形成偏振复用的所述组合光束；

14、对所述组合光束进行扩束与准直，使其充满显微物镜的后孔径。

15、作为本发明的进一步方案，将所述组合光束导入显微物镜，聚焦于样品所在区域，并收集穿过所述样品或被所述样品散射的光信号，包括：

16、所述扩展焦深照明光束在样品内形成延长的均匀照明焦区，用于对所述样品进行大景深成像，同时所述光镊操控光束在所述照明焦区内形成三维光势阱，用于捕获并操控所述样品中的微纳粒子；

17、所述光信号包含所述扩展焦深照明光束产生的成像信号以及所述光镊操控光束与粒子相互作用产生的散射信号；

18、所述扩展焦深照明光束在样品内形成延长的均匀照明焦区，用于对所述样品进行大景深成像，同时所述光镊操控光束在所述照明焦区内形成三维光势阱，用于捕获并操控所述样品中的微纳粒子，具体包括：

19、所述组合光束经显微物镜聚焦后，所述扩展焦深照明光束的相位调制波前在焦平面附近沿光轴方向产生自重建特性，从而在样品内形成一个沿光轴方向尺寸大于传统点聚焦的照明区域，所述照明区域即为所述延长的均匀照明焦区；

20、所述照明焦区在轴向的强度分布均匀，使得位于所述照明焦区轴向范围内的不同高度的样品结构能获得一致的照明强度，从而实现所述大景深成像；

21、同时，所述光镊操控光束因其环形强度分布或贝塞尔光束形态，在光束传播路径上形成一系列强度极大值点，所述强度极大值点构成所述三维光势阱；

22、所述三维光势阱在空间上与所述扩展焦深照明光束形成的所述延长的均匀照明焦区在轴向位置和横向范围上交叠，使得被捕获的微纳粒子位于成像照明区域内；

23、通过动态控制加载在所述第一空间光调制器上的计算全息图，改变所述光镊操控光束的波前，从而移动所述三维光势阱在所述照明焦区内的空间位置，实现对所述微纳粒子的三维捕获与操控。

24、作为本发明的进一步方案，所述对收集到的所述光信号进行分光与分离处理，将成像光路信号与光镊监测光路信号分离至不同的探测通道，具体包括：

25、将收集到的所述光信号引导至分光装置，所述分光装置根据波长、偏振态或光强的不同，将光信号分束至不同路径；

26、在成像光路方向上，设置带通滤光片，选择性地透过与所述扩展焦深照明光束波长对应的光，阻挡所述光镊操控光束波长的光及其他背景杂散光，形成所述成像光路信号；

27、在光镊监测光路方向上，设置四象限探测器或位置敏感探测器，用于接收经样品中粒子散射或折射的、与所述光镊操控光束相关的微弱信号，形成所述光镊监测光路信号；

28、对所述成像光路信号，利用透镜组将其成像于面阵科学级相机的感光面上；

29、对所述光镊监测光路信号，利用聚焦透镜将其汇聚于所述四象限探测器或位置敏感探测器的敏感区域中心。

30、作为本发明的进一步方案，所述改进的多焦点图像融合算法依据景深扩展后的点扩散函数模型进行优化，其工作原理包括：

31、预先标定或计算在所述扩展焦深照明光束照明条件下，系统的三维点扩散函数，得到所述景深扩展后的点扩散函数模型；

32、在成像过程中，利用所述扩展焦深照明光束照明样品，相机采集到一系列在不同轴向位置对焦的二维图像，构成原始图像堆栈；

33、对原始图像堆栈中的每一幅二维图像，利用所述景深扩展后的点扩散函数模型，通过三维反卷积运算，估计所述二维图像对应的样品层在三维空间中的光强分布；

34、从三维反卷积运算得到的初步三维光强分布中，提取每个轴向层面的图像信息，并根据相邻层面的信息冗余度与信噪比，自适应地确定每个图像区域的最优聚焦位置；

35、将各层图像在其最优聚焦位置的像素值，基于局部图像清晰度评价函数进行加权融合，重建出整个样品区域的清晰二维图像；

36、通过轴向扫描或利用所述扩展焦深照明光束的景深信息，将不同对焦位置重建的清晰二维图像进行三维拼接，最终生成所述样品的三维结构图像。

37、作为本发明的进一步方案，所述对原始图像堆栈中的每一幅二维图像，利用所述景深扩展后的点扩散函数模型，通过三维反卷积运算，估计所述二维图像对应的样品层在三维空间中的光强分布，包括：

38、将原始图像堆栈中的单幅二维图像视为三维样品结构被三维点扩散函数卷积后的一个二维投影；

39、建立成像模型，将所述三维样品结构、所述景深扩展后的点扩散函数模型、以及采集到的二维图像通过卷积方程关联；

40、采用迭代反卷积算法求解所述卷积方程，所述迭代反卷积算法在每次迭代中更新对三维样品结构的估计；

41、在迭代过程中，引入总变分正则化约束，以抑制由噪声和反卷积过程本身引起的非物理振荡或不稳定性，获得更平滑且物理上更可信的三维光强分布估计；

42、当迭代结果收敛，或达到预设的迭代次数时，停止迭代，此时的二维图像所对应的三维光强分布即为估计得到的样品层在三维空间中的光强分布。

43、作为本发明的进一步方案，所述在光镊监测通道，分析所述光镊监测光路信号，计算被捕获粒子的三维位置、捕获刚度及所受光学力，包括：

44、从所述四象限探测器或位置敏感探测器读取与粒子位移相关的电压信号，所述电压信号的变化反映粒子在探测器平面内两个垂直方向上的偏离量；

45、根据所述电压信号与粒子实际位移之间预先标定的比例关系，将电压信号转换为粒子在横向平面内的二维位置坐标；

46、通过分析所述光镊操控光束在轴向形成的势阱梯度特性，利用探测器信号强度与粒子轴向位置的相关性，计算粒子在光轴方向的轴向位置，结合横向二维位置坐标得到所述被捕获粒子的三维位置；

47、记录粒子在无外部扰动下，在光阱中由于热运动而产生的布朗运动轨迹，对所述布朗运动轨迹进行功率谱分析，拟合得到洛伦兹曲线，从拟合参数中计算得到所述捕获刚度；

48、根据所述被捕获粒子的三维位置相对于光阱中心的位移，以及所述捕获刚度，依据胡克定律计算所述被捕获粒子所受的光学力在三个方向上的分量。

49、作为本发明的进一步方案，通过分析所述光镊操控光束在轴向形成的势阱梯度特性，利用探测器信号强度与粒子轴向位置的相关性，计算粒子在光轴方向的轴向位置，包括：

50、在光镊系统初始化阶段，通过轴向扫描已知尺寸的标定微球，记录标定微球在不同轴向位置时，所述四象限探测器或位置敏感探测器输出的总光强信号或差分信号的变化曲线，建立轴向位置-信号强度查找表；

51、在实际捕获和测量阶段，实时监测所述四象限探测器或位置敏感探测器输出的总光强信号或差分信号；

52、将实时监测到的信号强度值与所述轴向位置-信号强度查找表进行比对，查找出与之最匹配的信号强度值对应的轴向位置；

53、对查找结果进行插值处理，以提高轴向位置定位的分辨率；

54、结合粒子横向位置的计算结果，输出粒子的完整三维空间坐标。

55、作为本发明的进一步方案，所述基于重建出的所述样品的三维结构图像与计算得到的所述被捕获粒子的三维位置，在三维空间中可视化呈现粒子与样品结构的相对关系，包括：

56、建立统一的三维空间坐标系，将所述样品的三维结构图像的体素坐标与所述被捕获粒子的三维位置坐标转换至统一坐标系下；

57、在三维渲染环境中，加载所述样品的三维结构图像，以体绘制或表面绘制的方式显示样品的三维形态；

58、在所述三维渲染环境中，以高亮的、可自定义形状和颜色的标记点，动态标定所述被捕获粒子的实时三维位置；

59、根据用户交互指令，可动态调整三维渲染视图的视角、缩放比例，并可开启剖面显示功能，以观察粒子与样品内部结构的空间关系；

60、实时更新所述被捕获粒子的三维位置，并在三维渲染环境中同步更新标记点的位置，形成粒子在样品三维结构内运动的动态可视化画面。

61、作为本发明的进一步方案，所述建立统一的三维空间坐标系，包括：

62、以显微物镜的光轴方向为所述统一的三维空间坐标系的z轴，以垂直于光轴且相互正交的两个方向为x轴和y轴；

63、在样品台上放置具有已知空间特征的校准样品，通过三维成像获得校准样品的图像；

64、识别校准样品图像中已知特征点的三维图像坐标，与特征点在样品台上的实际物理坐标建立对应关系；

65、通过求解坐标变换参数，建立图像体素坐标到统一的三维空间坐标系物理坐标的转换关系；

66、对光镊监测通道计算的粒子三维位置，将其原始坐标通过预先标定的转换关系，映射到所述统一的三维空间坐标系，确保成像坐标与操控坐标的空间一致性。

67、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

68、两路光束完成空间同轴合束处理，整合形成统一的组合光束，依托同一显微物镜完成光路传输与样品聚焦作用。统一化的光路排布能够精简光学系统内部器件配置，简化整体光路布设结构，规避多组独立光路并行布设带来的结构冗余。成像光束与光镊操控光束保持同轴传输路径，成像作业与光镊操控作业可在同一观测区域同步进行，消除分体光路架构下观测点位不统一的问题，统一光学聚焦路径，减少多光路独立运行产生的光路偏移，让样品单一观测区域同时承载成像探测与光学捕获两类光学作用，实现光学成像与光镊操控的光路集成化运行。

69、依托景深扩展后的点扩散函数模型，完成多焦点图像融合算法的针对性优化，调整算法运算逻辑以适配扩展焦深成像的光学传输特征，弥补常规算法模型适配场景单一的不足。优化成像光路信号的融合处理逻辑，完善样品三维结构的重建效果。对光镊监测通道的光路信号开展量化分析，解算获取被捕获粒子三维位置、捕获刚度以及光学力相关参数。结合重建完成的样品三维结构信息，匹配粒子空间坐标数据，完成三维空间内部粒子与样品结构相对状态的可视化展示，打通成像探测与光镊监测的数据链路，实现两类检测数据的同步调用与融合处理，完善微观观测过程中的参数解析与空间表征能力。