一种自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡及其制备与应用

本发明属于生物医药纳米，具体涉及一种自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡及其制备与应用。

背景技术：

1、周围神经病变是一类以神经元结构或功能的渐进性、选择性丧失（包括神经元死亡）为特征，进而引发功能障碍的疾病，表现为典型的局部病变。其涵盖糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，dpn）和肌萎缩侧索硬化症等。目前，这类疾病尚未明确具体病因，现有的治疗手段尚未能显著改变其病程进展，不仅严重威胁全球公共健康，还因长期护理及治疗需求对社会经济造成沉重负担。周围神经病变的治疗策略发展正面临多重挑战：一方面需在局部病理环境中突破小核酸药物稳定性不足、神经细胞特异性识别不足和细胞内内体逃逸能力不足的神经元递送瓶颈，另一方面需应对复杂的病理机制网络如神经元线粒体功能障碍与脑源神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，bdnf）作用通路受阻。因此，亟需一种能够在同一时空范围内兼顾高效、精准和安全的神经元递送与重塑线粒体代谢支持的治疗策略。

2、植物来源的外泌体囊泡因其优异的生物相容性、低免疫原性及内源性活性成分（如功能性mirna、脂质等），广泛参与细胞间的信息交流和物质交换，被视为颇具前景的天然药物递送载体。部分传统中草药植物，具有补血活血、通络止痛之效，其提取物已被证实具有代谢调节与神经保护活性。因此，药用植物外泌体囊泡可能作为治疗性纳米平台，发挥对周围神经病变的治疗作用。同时，使用药用植物外泌体囊泡携载sirna，以针对性地下调pten（phosphatase and tensin homolog，磷酸酶和张力蛋白同源物）关键致病基因表达可能是一种精准高效的补充策略，能够进一步促进神经元的生存，加速电生理恢复、髓鞘再生和神经支配。

3、采用局部给药途径相比口服给药，具有直接作用病变部位、快速增加病变部位药物浓度和减少全身毒副作用等优点。然而，周围神经病变的局部微环境存在各种酶、炎症因子和分泌物，往往会造成植物外泌体囊泡和sirna的非特异性摄取损失及其携载的小核酸药物的脱落和降解。同时，未经修饰的载体进入病变部位后往往呈现非特异性分布，难以识别和富集于周围神经，阻碍了植物外泌体囊泡和携载的sirna的靶向内化。最后是溶酶体逃逸难题，药物载体即使被细胞摄取，也常被隔离在溶酶体中降解，导致治疗载荷无法释放进入细胞质发挥作用。因此，对植物外泌体囊泡进行进一步智能化工程改造，开发一种整合了保护性、响应性的自组装纳米凝胶和植物外泌体囊泡携载的mirna/sirna线粒体功能改善作用，使其具有局部微环境稳定和响应性释放、识别神经细胞、加速内化和促进内体逃逸能力的智能纳米药物系统，对于实现周围神经病变的精准多维治疗具有重要的科学价值与临床潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡及其制备与应用。本发明提供的自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡能够克服周围神经病变局部微环境对药物的降解，精准识别和粘附神经细胞，并通过改善线粒体功能障碍和清除致病基因阻碍的双重机制协同治疗周围神经病变。本发明的自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡，其内核为源自中药植物（以当归为例）的天然外泌体囊泡（以当归外泌体囊泡aev为例），所述内核表面负载有靶向pten基因的sirna（sirpten）；外壳为包裹在所述内核表面的sirpten与单宁酸自组装形成的纳米凝胶；表面修饰层为插入所述内核脂质双分子层中的th多功能配体。

2、根据本发明的第一方面，本发明首先提供了一种自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡（thaev@sir-tagel）的制备方法，其包括如下步骤：

3、1）将th多功能配体修饰在植物外泌体囊泡表面，所述th多功能配体由神经细胞特异性粘附肽、溶酶体逃逸肽和棕榈酸基团聚合而成；

4、2）向步骤1）体系中加入靶向致病基因的sirna，将其负载在步骤1）修饰后的植物外泌体囊泡的表面；

5、3）向步骤2）体系中加入过量的单宁酸溶液，在植物外泌体囊泡表面自组装形成纳米凝胶层，所述纳米凝胶层由所述sirna与单宁酸通过氢键链接自组装形成，从而得到所述自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡。

6、根据本发明的优选方案，所述步骤1）包括：将th多功能配体与植物外泌体囊泡溶液在37℃条件下共孵育，使所述th多功能配体修饰于所述植物外泌体囊泡表面；所述植物外泌体囊泡蛋白质质量与th多功能配体的质量比为2：1~4：1。

7、根据本发明的优选方案，所述的th多功能配体由神经细胞特异性粘附肽、溶酶体逃逸肽和棕榈酸基团共同组成，其中，神经细胞特异性粘附肽的氨基酸序列为hlnilstlwkyr（seq id no.1所示）；该序列能够结合神经细胞膜表面特有的三唾液酸神经节苷脂受体gt1b，以促进智能植物外泌体囊泡在神经细胞的特异性识别、摄取和内化。优选的，棕榈酸基团为十六碳脂肪酸残基，其通过酰胺键与所述th多功能配体的赖氨酸残基连接。

8、进一步的，所述溶酶体逃逸肽为寡组氨酸序列hn，其中，组氨酸h的数量n为2、4、6、8、10、12中的任意数字。所述溶酶体逃逸肽通过含有的咪唑环的质子化触发质子海绵效应造成溶酶体的膨胀和膜破坏。

9、所述th多功能配体的结构表示为：hlnilstlwkyr+hn-lys（pal）。

10、根据本发明的优选方案，所述的植物为五味子、人参、酸枣仁、川芎、三七、当归、冬凌草、石菖蒲、葛根、天麻、黄芪中的一种或多种。优选的，所述植物为当归。

11、根据本发明的优选方案，所述植物外泌体囊泡由植物主要入药部分的新鲜组织采用差速超速离心法提取。典型而非限定的，所述植物外泌体囊泡的制备方法为：加入适量的pbs等缓冲盐溶液，充分破碎新鲜植物组织并获得其粗提液。将所述粗提液分别经过1000~150000 g的差速离心，然后去除上清液。使用pbs等缓冲盐溶液将沉淀重悬后过滤得到植物外泌体囊泡。

12、根据本发明的优选方案，所述步骤2）包括：向步骤1）所得体系中加入带有3'胆固醇修饰的sirna，在冰水浴条件下共孵育，使所述sirna负载于所述植物来源外泌体囊泡表面；以所述植物外泌体囊泡含有的总蛋白质量计量其质量，植物外泌体囊泡的质量与sirna的吸光度值配比为100~200 μg：0.2 ~1 od。

13、根据本发明的优选方案，所述的sirna为靶向糖尿病周围神经病变中致病pten基因的sirpten，所述sirpten序列包含但不限于pten-rat-1373、pten-rat-1511、pten-rat-1248、pten-rat-1142，其正义链和反义链序列见表1，表1中序列从前到后分别对应序列表中的seq id no.2~ seq id no.9。

14、表1

15、

16、根据本发明的优选方案，步骤3）具体为：向步骤2）所得体系中加入单宁酸溶液，在冰水浴条件下共孵育，使所述sirna与所述单宁酸通过氢键链接在所述植物来源外泌体囊泡表面自组装形成纳米凝胶层。优选的，所述单宁酸过量，具体投入质量不做限制。

17、根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡，其采用前述的方法制备得到。

18、根据本发明的第三方面，本发明还提供了一种所述自组装纳米凝胶包封的智能植物外泌体囊泡的应用，具体为用于制备治疗周围神经病变的药物；所述的周围神经病变可为糖尿病周围神经病变造成的疾病，或肌萎缩侧索硬化症等。

19、与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：

20、（1）协同双重治疗机制：本发明将靶向致病基因的外源活性sirna与植物外泌体囊泡内源性生物活性成分有机整合。sirpten靶向糖尿病周围病变的致病pten基因，从源头减少造成bdnf功能障碍的pten蛋白表达，恢复bdnf支持的神经元修复过程；同时，植物外泌体囊泡携带的内源性活性分子激活相关信号轴，促进线粒体功能障碍的改善。这种协同作用，能更有效地打破周围神经病变的恶性病理循环。

21、（2）精准病灶靶向：表面修饰的tet1肽加强植物外泌体囊泡在神经细胞的特异性识别、粘附和内化。引入的hn多肽片段具有质子海绵效应，在内吞体/溶酶体的酸性环境中质子化，导致膜破裂，从而实现药物的胞质高效释放，避免被溶酶体降解。

22、（3）局部微环境响应性释放：利用自组装纳米凝胶中氢键链接在病灶部位的氧化应激或低ph条件下解离的特性，实现了植物外泌体囊泡及sirna的响应性释放，避免了其在病灶环境中的降解，并支持了随后的神经元靶向。

23、（4）安全性高：本发明主要载体材料源自天然植物和生物本身含有的sirna，具有良好的生物相容性和低免疫原性。体内实验证实，给药未引起明显的心、肝、肾等主要脏器毒性，具有良好的临床转化潜力。