基于同位素内标蛋白的食品中β-酪蛋白定量分析方法与流程

本发明属于食品检测，具体涉及一种基于同位素内标蛋白的食品中β-酪蛋白定量分析方法。

背景技术：

1、食物过敏是食品安全和公共卫生领域的突出问题，影响全球约1-2%的成人和5-8%的儿童。其中，牛奶过敏是婴幼儿和儿童时期最常见的食物过敏类型，严重影响过敏人群的生活质量和身体健康。目前，很多国家对减少乳制品致敏性的研究给予高度重视，致力于推动牛奶过敏原精确分析与检测手段的发展，并完善食品标签制度。基于此，构建一种高灵敏度、高特异性的分析检测方法对保障牛奶过敏人群的健康安全和检验预包装致敏标签是否真实有效具有重要意义。

2、常见的牛奶过敏原主要分为酪蛋白和乳清蛋白两大类，此外还有如乳铁蛋白之类的潜在过敏原。其中，酪蛋白主要包含β-酪蛋白、α-酪蛋白和κ-酪蛋白。乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等。

3、目前，常用的食物过敏原检测技术主要为免疫测定法和基因检测法，基因检测法是基于dna扩增技术的分子生物学方法，特异性较高且不易受交叉反应影响，但对于牛奶及其加工食品这类dna仅微量存在的样品来说，在定量准确性方面仍需进一步提升；免疫测定法利用抗原抗体特异性结合，通过酶作用于底物后产生的显色变化来对样品中待测过敏原进行定性和定量分析，但该方法易受交叉反应和复杂基质影响，容易产生假阳性或假阴性结果。

4、随着科学技术的发展，液相色谱-串联质谱技术被广泛应用于食物过敏原的检测。该技术将液相色谱与质谱联用，先通过液相色谱将样品中的肽段分离，然后通过质谱进行电离和检测。串联质谱可以进一步对肽段进行碎片化，提供更详细的肽段序列信息，使灵敏度和特异性得到显著提高。该方法能够进行多靶标检测，灵敏度高、特异性好。然而，由于现有的检测方法多数是采用人工合成的多肽作为内标，不能校正食品中过敏原的提取、酶解等环节产生的误差，导致过敏原蛋白定量的准确性不高。

5、为了改善现状，本研究引入细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术（stableisotope labeling by amino acids in cell culture, silac），通过在关键氨基酸合成基因缺陷大肠杆菌内构建同位素蛋白作为内标，有效校正了样品提取、酶解、净化环节产生的误差，解决复杂食品基质中食物过敏原定量不准确的问题，建立高灵敏度、高特异性的过敏原痕量精准定量检测技术。

技术实现思路

1、本发明旨在利用液相色谱-串联质谱技术，结合重组蛋白同位素标记技术建立一种针对牛奶过敏原β-酪蛋白的精准定量分析技术，所述技术具有准确、灵敏、可靠的特点，能够精准检测多种复杂食品基质中β-酪蛋白的含量，为牛奶过敏原风险评估和保障过敏人群健康提供科学依据，并能对市售加工食品中的β-酪蛋白进行标签一致性评价。

2、本发明包括如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种食品中β-酪蛋白定量分析方法，所述方法包括向待检样品加入同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白作为内标，经胰蛋白酶酶解后进行lc-ms/ms分析，选择β-酪蛋白特征肽段，根据内标法计算β-酪蛋白含量。

4、本发明所述的食品包括任何可能含有牛奶过敏原β-酪蛋白的食品，包括但不限于奶粉原料、配方奶粉、果酱、面包、饼干、蛋糕、馒头、零食、麦片、米糊或烘焙预混粉。

5、本发明所述的同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，其中，所述序列中的赖氨酸（k）和精氨酸（r）为碳氮全同位素标记的氨基酸。

6、同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白氨基酸序列（seq id no.1）如下：

7、mgsshhhhhhssglvpr*gshmasmk*vlilaclvalalar*eleelnvpgeiveslssseesitr*ink*k*iek*fqseeqqqtedelqdk*ihpfaqtqslvypfpgpihnslpqnippltqtpvvvppflqpevmgvsk*vk*eamapk*hk*empfpk*ypvepftesqsltltdvenlhlplpllqswmhqphqplpptvmfppqsvlslsqsk*vlpvpqk*avpypqr*dmpiqafllyqepvlgpvr*gpfpiiv

8、在本发明的一个具体实施方式中，所述同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白通过如下方法制备得到：

9、1）以e.coli bl21(de3)作为出发菌株，构建赖氨酸和精氨酸营养缺陷型菌株e.coli bl21(de3)δlys/δarg；

10、2）将seq id no.2所示的β-酪蛋白基因导入载体质粒中构建重组质粒，并将重组质粒转入菌株e.coli bl21(de3)δlys/δarg中构建重组工程菌；

11、3）使用赖氨酸和精氨酸缺陷培养基，并加入同位素标记的赖氨酸和精氨酸作为同位素标记培养基，将步骤2）的重组工程菌在同位素标记培养基中进行多次传代，诱导表达，分离纯化得到同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白。

12、在本发明的一些可选实施方式中，步骤2）中所述的载体质粒选自pet、pex、gst、pezz18或pkk223系列载体质粒。优选地，所述载体质粒选自pet。

13、在本发明的一些可选实施方式中，步骤3）中所述的同位素标记的赖氨酸和精氨酸包括标记赖氨酸和精氨酸上的c、n、h或o元素，其同位素包括13c，15n，2h，17o或18o，可以为一个或多个原子同时标记，可以为一个或多种元素同时标记。

14、在本发明的优选实施方式中，所述同位素标记的赖氨酸和精氨酸选自13c，15n全同位素标记的赖氨酸和精氨酸。

15、在本发明中，步骤3）中所述的赖氨酸和精氨酸缺陷培养基为包含除赖氨酸和精氨酸以外的，大肠杆菌生长所需的盐、糖、氮源及其他所有必须氨基酸的培养基。

16、进一步优选地，步骤3）中加入同位素标记的赖氨酸和精氨酸的浓度选自20~100mg/l。

17、根据本发明所述的食品中β-酪蛋白定量分析方法，在胰蛋白酶酶解之前还包括使用样品提取液进行样品提取，所述样品提取液为含有10 mol/l尿素和200 mmol/l tris-hcl的水溶液，ph=8。

18、根据本发明所述的食品中β-酪蛋白定量分析方法，在胰蛋白酶酶解之后还包括样品净化，所述净化选用oasis hlb premium（3cc）净化柱，活化后加入样品，选用0.1%甲酸水或0.1%氨水进行净化洗涤，选用40% acn（含0.1% fa）、60% acn（含0.1% fa）、80% acn（含0.1% fa）或90% acn（含0.1% fa）进行净化洗脱。

19、在本发明的优选实施方式中，选用0.1%甲酸水进行净化洗涤，选用60% acn（含0.1% fa）进行净化洗脱。

20、根据本发明所述的食品中β-酪蛋白定量分析方法，胰蛋白酶酶解时间选自6-8小时，优选6小时。

21、在本发明的一些可实施方式中，所述β-酪蛋白特征肽段选自avpypqr或vlpvpqk。

22、在本发明的最优选实施方式中，所述β-酪蛋白特征肽段选自vlpvpqk。

23、根据本发明所述的食品中β-酪蛋白定量分析方法，lc-ms/ms的条件如下：

24、1）色谱条件

25、色谱柱acquity uplc® peptide cshtm c18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；进样体积5 μl；流速0.3 ml/min；柱温40℃。流动相：0.1%甲酸水（a），0.1%甲酸乙腈（b）；梯度洗脱程序：0~0.5分钟，5% a；0.5~6.50分钟，5%~30% a；6.50~8.00分钟，30%~95% a；8.00~10.50分钟，95% a；10.50~13.00分钟，95%~5% a。

26、2）质谱条件

27、电喷雾离子源（esi+）；雾化气为氮气，流速为3.0 l/min；加热气为空气，流速为10l/min；干燥气为氮气，流速为10 l/min；碰撞气为氩气；离子源接口温度为300 ℃；脱溶剂管温度为526 ℃；加热模块温度为400 ℃；扫描模式为多反应监测（multiple reactionmonitoring，mrm）。

28、第二方面，本发明提供如下组合在定量分析检测食品中β-酪蛋白含量中的应用：

29、1）同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白；

30、2）同位素标记的β-酪蛋白特征肽段。

31、所述同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白为内标，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其中，所述序列中的赖氨酸（k）和精氨酸（r）为碳氮全同位素标记的氨基酸。

32、所述同位素标记的β-酪蛋白特征肽段选自vlpvpqk*或avpypqr*，其中，k*和r*为碳氮全同位素标记的氨基酸。

33、优选地，所述同位素标记的β-酪蛋白特征肽段选自vlpvpqk*。

34、本发明利用胰蛋白酶只作用于精氨酸 （r）和赖氨酸 （k）的专一性，把牛奶蛋白质酶切成肽段分子，从中选择特征肽段作为定量目标，同时，本发明使用同位素标记的β-酪蛋白重组蛋白作为内标参与酶解，经lc-ms/ms检测，根据内标法可以准确计算食品中牛奶过敏原β-酪蛋白的含量。