使包含骨的生物试样透明化的方法、调节包含骨的生物试样的折射率的方法、以及用于使包含骨的生物试样透明化的试剂盒

本发明涉及使包含骨的生物试样透明化的方法、调节包含骨的生物试样的折射率的方法、以及用于使包含骨的生物试样透明化的试剂盒。本技术基于在2024年4月4日在日本技术的特愿2024-061116号而主张优先权，并将其内容引用于此。

背景技术：

1、为了使用显微镜在体内（in vivo）观察脑内的神经细胞的活动，需要降低由头盖骨引起的光像差、光散射。与此相对，以往使用去除头盖骨的手术（例如，非专利文献1）、削薄头盖骨的手术（例如，非专利文献2）。

2、若去除头盖骨，则在其个体中，存在引起炎症反应、头盖内压的降低、脑脊髓液的流出等的问题。在将头盖骨削薄的手术中，存在能够观察的区域窄、在长期的实时成像中头盖骨再生的问题。

3、对此，提出了使用使头盖骨透明化的试剂，在体内观察脑内的神经细胞的活动的方法（例如，非专利文献3~5）。

4、现有技术文献

5、非专利文献

6、非专利文献1：

7、holtmaat, a.etal.long-term high-resolution imaging in the mouseneocortex through a chronic cranial window. nature protocols 4, 1128-1144（2009）.https://doi.org/10.1038/nprot.2009.89

8、非专利文献2：

9、xu,h.t.,pan,f.,yang,g.&gan, w.b.choice of cranial window type for invivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.natureneuroscience10,549-551（2007）.https://doi.org/10.1038/nn1883

10、非专利文献3：

11、li, d.etal. a through-intact-skull（tis）chronic window technique forcortical structure and function observation in mice. elight 2, 15（2022）.https://doi.org/10.1186/s43593-022-00022-2

12、非专利文献4：

13、zhao, y.j.etal.skull optical clearing window for in vivo imaging ofthe mouse cortex at synaptic resolution. light sci appl 7, 17153（2018）.https://doi.org/10.1038/lsa.2017.153

14、非专利文献5：

15、zhang, c.etal.alarge, switchable optical clearing skull window forcerebrovascular imaging. theranostics 8, 2696-2708（2018）.https://doi.org/10.7150/thno.23686

技术实现思路

1、发明要解决的技术问题

2、然而，在专利文献3~5所记载的方法中，存在成像的灵敏度、分辨率等不充分的问题。

3、因此，本发明的目的在于，提供适合用于脑的活动的成像的、使包含骨的生物试样透明化的新的方法、调节包含骨的生物试样的折射率的方法、以及用于使包含骨的生物试样透明化的试剂盒。

4、用于解决技术问题的技术方案

5、本发明包括以下的方式。

6、[1]一种使包含骨的生物试样透明化的方法，其包括：使中间溶剂与所述生物试样接触的工序；以及使有机溶剂系折射率调节剂和水性折射率调节剂与所述生物试样接触的工序，所述中间溶剂包含醇，所述有机溶剂系折射率调节剂包含下述通式（a-1）所示的化合物或其盐或它们的溶剂化物，所述水性折射率调节剂包含下述通式（b-1）所示的化合物或其盐或它们的溶剂化物，

7、[化学式1]

8、

9、式中，ra1和rb1各自独立地为取代基，rb2为取代基或氢原子，na1及nb1分别独立地为0~5的整数，rb3和rb4各自独立地为未取代的或具有取代基的碳原子数1~4的烷基或氢原子，

10、na1为2以上的整数时，2以上的ra1可以彼此相同，也可以不同，nb1为2以上的整数时，2以上的rb1可以彼此相同，也可以不同。

11、[2]根据[1]所述的方法，上述通式（a-1）和上述通式（b-1）中，ra1和rb1各自独立地表示未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基、未取代的或具有取代基的碳原子数2~6的烯基、未取代的或具有取代基的碳原子数2~6的炔基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷氧基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷硫基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基亚磺酰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基磺酰基、甲酰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基羰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基羧基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷氧基羰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基羰基氧基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基氨基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的-nr11-c（=o）-r12基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的-c（=o）-n（r13）（r14）基、卤素原子、羟基、氰基、氨基或硝基，r11、r12、r13及r14各自独立地表示烷基或氢原子，rb2各自独立地表示未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基、未取代的或具有取代基的碳原子数2~6的烯基、未取代的或具有取代基的碳原子数2~6的炔基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷氧基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷硫基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基亚磺酰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基磺酰基、甲酰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基羰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基羧基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷氧基羰基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基羰氧基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基氨基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的-nr21-c（=o）-r22基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的-c（=o）-n（r23）（r24）基、卤素原子、羟基、氰基、氨基、硝基或氢原子、r21、r22、r23和r24各自独立地表示烷基或氢原子。

12、[3]根据[1]所述的方法，所述通式（a-1）和所述通式（b-1）中，ra1表示未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基、未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷氧基、甲酰基、或者未取代的或具有取代基的碳原子数2~6的烯基，rb1表示未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基、或者卤素原子，rb2表示未取代的或具有取代基的碳原子数1~6的烷基、卤素原子或氢原子。

13、[4]根据[1]所述的方法，所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、二甘醇、或2,2’-硫代二乙醇。

14、[5]根据[4]所述的方法，所述醇为乙醇。

15、[6]根据[1]所述的方法，所述生物试样为存活的动物个体的生物试样。

16、[7]根据[1]所述的方法，所述生物试样为头盖骨。

17、[8]一种调节包含骨的生物试样的折射率的方法，其包括：使中间溶剂与所述生物试样接触的工序；和使有机溶剂系折射率调节剂和水性折射率调节剂与所述生物试样接触的工序，所述中间溶剂包含醇，所述有机溶剂系折射率调节剂包含下述通式（a-1）所示的化合物或其盐或它们的溶剂化物，所述水性折射率调节剂包含下述通式（b-1）所示的化合物或其盐或它们的溶剂化物，

18、[化学式2]

19、

20、式中，ra1和rb1各自独立地为取代基，rb2为取代基或氢原子，na1及nb1分别独立地为0~5的整数，rb3和rb4各自独立地为未取代的或具有取代基的碳原子数1~4的烷基或氢原子，

21、na1为2以上的整数时，2以上的ra1可以彼此相同，也可以不同。nb1为2以上的整数时，2以上的rb1可以彼此相同，也可以不同。

22、[9]一种用于使包含骨的生物试样透明化的试剂盒，其具有下述通式（a-1）所示的化合物或其盐或它们的溶剂化物、和下述通式（b-1）所示的化合物或其盐或它们的溶剂化物，

23、[化学式3]

24、

25、式中，ra1和rb1各自独立地为取代基，rb2为取代基或氢原子，na1及nb1分别独立地为0~5的整数，rb3和rb4各自独立地为未取代的或具有取代基的碳原子数1~4的烷基或氢原子，

26、na1为2以上的整数时，2以上的ra1可以彼此相同，也可以不同，nb1为2以上的整数时，2以上的rb1可以彼此相同，也可以不同。

27、[10]用于使[9]所述的含有骨的生物试样透明化的试剂盒，其还具有含有醇的中间溶剂。

28、发明效果

29、根据本发明，能够提供适合用于脑的活动的成像的、使包含骨的生物试样透明化的新的方法、调节包含骨的生物试样的折射率的方法、以及用于使包含骨的生物试样透明化的试剂盒。