一种基于稀硝酸加热快速提取的有机稻米和非有机稻米的识别方法

本发明涉及生物检测，具体涉及一种基于稀硝酸加热快速提取的有机稻米和非有机稻米的识别方法。

背景技术：

1、有机产品和普通产品之间的差异无法通过肉眼观察，有机产品真实性识别的方式依赖化学方法。目前，基于蛋白组学和代谢组学的方法可以区分有机稻米和非有机稻米。

2、代谢组学方法通过检测有机与非有机稻米种植方式导致的内源性小分子代谢物（如氨基酸、次生代谢产物等）的组成和含量差异来实现鉴别。该方法首先将稻米样品粉碎后采用70%甲醇水溶液超声提取，经离心和过膜处理后，应用超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱（uhplc-q-tof ms）对代谢物进行分离和检测，获取总离子流色谱图原始数据后，经ms convert软件格式转换和xcms软件峰提取、对齐、去噪音等预处理步骤，最终通过正交偏最小二乘-判别分析（opls-da）模型实现有机与非有机稻米的区分，并利用s-plot筛选潜在生物标志物。该方法能够从代谢物整体层面反映种植方式差异，具有较高的区分可视化效果。然而，该方法存在技术问题：第一，非靶向代谢组学依赖数据库进行物质鉴定，最终筛选出的30个潜在标志物中仅有8个得到明确鉴定，10个完全未知，数据解析不确定度高；第二，前处理需使用有机溶剂且依赖超声、低温高速离心等设备，操作步骤繁琐；第三，uhplc-q-tof ms仪器昂贵（200万元以上）且需高纯有机流动相，运行成本高，推广普及难；第四，从样品前处理到色谱-质谱分析全流程需2小时以上且整套系统无法便携化，完全不适用于田间、仓库或批发市场等现场快速筛查场景。

3、蛋白组学方法通过检测有机与非有机稻米种植方式导致的蛋白质表达差异来实现鉴别。该方法首先将稻米样品用液氮研磨成粉末，加入std缓冲液经沸水浴和超声破碎提取蛋白粗提液，随后采用fasp酶解方法，经二硫苏糖醇还原、碘乙酰胺烷基化、超滤离心及胰蛋白酶37℃过夜水解等步骤将蛋白酶解为多肽，最后利用毛细管液相色谱串联三重四极杆质谱（nanolc-ms/ms）对酶解产物进行分离和鉴定，获得蛋白信息后经数据库搜索和缺失筛选获得差异蛋白，基于差异蛋白含量数据建立偏最小二乘-判别分析（pls-da）模型进行鉴别。该方法从蛋白表达层面反映种植条件影响，具有较高的生物学相关性。

4、然而，该方法存在技术问题：第一，样品前处理复杂，涉及液氮研磨、超声破碎、还原、烷基化、超滤、过夜酶解等数十个操作步骤，单个样品全流程需18至24小时，检测通量极低，完全无法满足快速检测需求；第二，极度依赖大型精密仪器（nanolc-ms/ms，300至500万元）和专用生化试剂，运行维护成本极高；第三，数据处理依赖uniprot蛋白质数据库（含168272条序列）的搜索匹配，从1661个蛋白中经多步筛选才获得114个差异蛋白用于建模，过程复杂且存在较高的匹配假阳性率；第四，整套方案从样品保存（需液氮速冻）到分析检测均依赖专业实验室环境，严重制约了该方法的实际推广应用。

技术实现思路

1、针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于稀硝酸加热快速提取的有机稻米和非有机稻米的识别方法，本发明引入非完全消解法，以缩短样品前处理步骤和时间、减少浓硝酸加入量，建立环保、经济、高效的提取方法。采用电感耦合等离子体质谱/发射光谱（icp-ms/oes）对快速处理后的样品进行分析，无需使用标准溶液即可获取各元素的信号强度。

2、为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种基于稀硝酸加热快速提取的有机稻米和非有机稻米的识别方法，其特征在于，包括如下步骤：

3、（1）、建立判断模型

4、s1 采集有机稻米标准样品、非有机稻米标准样品；

5、s2 将稻米样品清洗、干燥、粉碎后过80目筛；

6、s3 稀酸低温提取：称取粉碎样品，加入稀硝酸提取液，所述稀硝酸提取液由一级水与浓硝酸按照体积比 9:1~1:1混合配制而成；120~130℃加热提取；冷却后加入混合内标溶液，定容得到上机液，同步设置空白对照；所述混合内标包含50μg/l铟、200μg/l锗、200μg/l钇；

7、s4采用 icp-oes 或 icp-ms 测定空白、稻米样品的多元素信号强度；

8、s5 特征元素信号筛选

9、选择信号强度的平均值应大于10，且信号强度的平均值应大于空白样品信号值的3倍，经过以上筛选得到特征信号元素；

10、s6获得稻米中多种元素经校正后的信号强度值

11、用样品中ge 、re 、y的信号强度与空白中对应的元素的信号强度的比值作为强度校正系数a。强度校正系数一般应在0.7~1.3之间。各元素经校正后的信号强度值i2为原信号强度值i1与强度校正系数a的比值减去空白强度平均值的差值，即i2=i1/a - i0；

12、s7模型建立

13、采用spss软件逐步判别分析筛选8个关键指标：85rb、75as、88sr、11b、si（251.611nm）、ca（396.847 nm）、mn（259.372 nm）、138ba，所得费希尔判别函数如下：

14、非有机稻米：f1 = –2.52×85rb + 1.26×88sr– 1.68×75as + 2.29×11b + 2.07×si（251.611 nm）– 2.39×ca（396.847 nm）– 1.24×mn（259.372 nm）– 0.79×138ba –2.60（常量）；

15、有机稻米：

16、f2 = –2.48×85rb – 1.68×88sr + 1.90×75as – 2.02×11b – 2.04×si（251.611 nm）+ 2.06×ca（396.847 nm）+ 1.74×mn（259.372 nm）– 0.82×138ba – 2.51（常量）

17、（2）、待测样品判别

18、a待测稻米按照 s2~s6处理，获取 8 个核心指标校正后的信号强度值；

19、b 将信号强度值分别代入 f1、f2计算函数值；

20、c 判定规则：f1≥f2为非有机稻米，f2＞f1为有机稻米。

21、本发明引入非完全消解法，以缩短样品前处理步骤和时间、减少浓硝酸加入量，建立环保、经济、高效的提取方法。采用电感耦合等离子体质谱/发射光谱（icp-ms/oes）对快速处理后的样品进行分析，无需使用标准溶液即可获取各元素的信号强度，结合内标溶液的使用，能够快速、高效地获得稻米中各元素相对于内标溶液的相对信号强度，并用于有机稻米和非有机稻米的鉴别。

22、上述方案中：s3中，在多孔石墨炉消解仪上加盖加热30min，加热中途需要手摇荡离心管，以使混合物均匀分布并溶解，然后揭盖，再加热10分钟后，冷却，取出离心管。

23、上述方案中：s4中，icp-ms 检测元素包含 24mg、114cd、¹¹b、208pb、63cu、52cr、88sr、57fe、51v、85rb、118sn、98mo、75as、59co、138ba；icp-oes 检测谱线包含 p（213.617 nm）、si（251.611 nm）、k（766.490 nm）、zn（213.857 nm）、al（396.153 nm）、fe（239.562 nm）、mn（259.372 nm）、mg（285.213 nm）、s（181.975 nm）、ca（396.847 nm）。

24、上述方案中：icp-ms仪器参数：发射功率 1500w，等离子气 1.5l/min，辅助气 1.2l/min，雾化气 0.92 l/min，氦气流量 40 ml/min，泵速 42 rpm，采样深度1930±120nm，停留时间 12.5 ms，测定模式动态能量歧视。

25、上述方案中：icp-oes 参数：功率 1300 w，等离子体流量 15 l/min，辅助气 0.2l/min，雾化气 0.5 l/min，泵速 1.5 ml/min，峰面积定量。

26、上述方案中：校正系数控制在 0.7~1.3 之间。

27、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

28、（1）本发明技术路线基于元素指纹和稀硝酸不完全消解，解决现有技术设备贵、流程长、检测通量低的痛点。

29、（2）传统元素溯源均采用浓酸完全消解配合标准品定量，本发明采用稀硝酸低温快速提取、仅用相对信号强度建模，相对于用强浓酸、高温长时间加热的完全消解手段，省去标准曲线配制，简化流程，具有突出的改进。

30、（3）本发明筛选特定 8 组特征元素得到费希尔判别函数，通过实验数据证明高判别准确率，带来显著技术效果。

31、本发明相比蛋白组学、代谢组学识别方法，在前处理简便性、分析通量、仪器普及性等方面均具有显著优势。本发明与上述两种组学方法的检测原理和技术路径完全不同，且能够解决组学方法普遍存在的“依赖实验室环境、操作繁琐、耗时长”等共性痛点。