松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法与流程

本发明涉及化学成分的检测方法，特别是涉及一种松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法。

背景技术：

1、松花粉（pine pollen）为松科植物马尾松、油松及同属近缘植物的干燥花粉，是我国传统药食同源品种，收录于《中华人民共和国药典》，具有收敛止血、燥湿敛疮之功效，临床常用于外伤出血、湿疹、黄水疮、皮肤糜烂等。现代药理研究表明，松花粉具有抗氧化、抗炎、免疫调节、保肝、调节血脂、抗疲劳及改善肠道微生态等多种生物活性，在保健食品、特医食品及功能性膳食领域具有应用潜力。松花粉属于典型风媒花粉，飘散至空气后可形成花粉气溶胶，可能诱发季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎等过敏性疾病，是重要的致敏原之一，其相关健康风险值得关注。松花粉化学成分种类多、结构差异大、含量跨度宽，共同构成其多靶点、多通路作用的物质基础。

2、天然产物的化学成分复杂，传统的薄层色谱、液相色谱等方法难以同时实现复杂基质中多组分的高效分离和可靠鉴定。仅依赖液相色谱保留时间和紫外等检测信息时，难以对共洗脱组分或分离不完全的色谱峰作出可靠定性。松花粉传统提取方式多为水提、醇提和回流提取，存在提取时间较长、效率有限、热敏性成分可能降解及溶剂消耗较大等问题，难以满足高效、绿色和标准化提取需求。目前松花粉研究多集中于总黄酮、总酚、多糖等大类成分的含量测定，或单一活性成分的分离纯化，基于高分辨质谱的多成分系统鉴定与质谱裂解规律研究仍较为缺乏。因此，将超声/微波辅助萃取与高分辨质谱联用，对松花粉进行系统性化学成分鉴定，分析其主要化学成分及代表性成分的裂解特征，可为松花粉的质量评价和物质基础研究提供依据。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法。

2、本发明松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法以松花粉为研究对象，采用超声/微波辅助萃取进行样品前处理，结合uhplc-q/orbitrap hrms技术，在正、负离子模式下进行化学成分筛查与鉴定，依据保留时间、精确质量数、同位素峰分布、二级碎片离子及数据库检索结果进行初步鉴定，并对代表性化合物的质谱裂解规律进行分析。研究结果可为松花粉的质量评价和化学物质基础研究提供参考。

3、本发明松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法，包括如下步骤：

4、（1）样品处理：采集松花粉样品，萃取并预处理后，得到待测溶液；

5、（2）采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱的方法，对松花粉中的小分子化学成分进行系统分离与鉴定；

6、（3）数据处理：包括建立数据库、数据采集和处理、相关文献查找、代表性化合物选取及裂解规律推导。

7、本发明所述的松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法，其中：步骤（2）中所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱的方法中色谱条件如下：

8、色谱系统配备acquity uplc hss t3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相由a相和b相组成，其中，a相为0.1%甲酸水溶液，b相为乙腈；梯度洗脱程序：0~1 min，2%b；1~14min，2%~30%b；14~25 min，30%~100%b；25~28 min，100%b；28~28.1 min，100%~2%b；28.1~29.5 min，2%b。流速为0.3 ml/min，柱温为40 °c，进样量为6.0 µl。

9、本发明所述的松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法，其中：步骤（2）中所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱的方法中质谱条件如下：

10、采用配备电喷雾离子源的四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪进行质谱分析；

11、正、负离子模式下的喷雾电压分别为3.7 kv和3.5 kv；毛细管温度为320 °c；鞘气和辅助气压力分别为30 psi和10 psi；辅助气加热温度为300 °c；鞘气和辅助气均为氮气；碰撞气为氮气，压力为1.5 mtorr；采用全扫描-数据依赖型二级质谱模式采集数据，fullms参数：分辨率70000，自动增益控制目标1×106，最大注入时间50 ms，质荷比扫描范围

m/z 100~1500；dd-ms2参数：分辨率17500，自动增益控制目标1×105，最大注入时间50 ms，采用top 10模式采集二级质谱数据，并启用动态排除，隔离窗口为2.0

m/z，归一化碰撞能量为10、30和60；触发二级质谱的离子强度阈值为1×105。

12、本发明所述的松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法，其中：步骤（3）中的数据处理过程如下：

13、采用xcalibur 4.1软件采集原始数据，并采用progenesis qi 3.0软件进行峰提取、去卷积和特征峰归属；以公开文献、otcml中药成分高分辨质谱数据库和自建数据库为依据，对候选化合物进行检索；综合色谱保留时间、前体离子精确质量数及质量误差、同位素峰分布、二级碎片离子、数据库匹配结果和文献报道等信息进行综合判定，对候选化合物进行初步鉴定。

14、本发明所述的松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法，其中：步骤（3）中的数据处理过程具体包括如下步骤：

15、1）建立数据库：基于公开文献和otcml中药成分高分辨质谱数据库，收集松花粉中可能存在的化学成分的名称、分子式、精确相对分子质量、加合离子类型、特征碎片离子信息及化合物类别，建立松花粉化学成分数据库；

16、2）采用xcalibur 4.1软件进行数据采集，全面记录化合物的一级质谱与二级质谱信息；

17、3）使用progenesis qi 3.0软件对采集的原始质谱数据进行峰提取、去卷积和特征峰归属；将处理后的数据与otcml中药成分高分辨质谱数据库及自建数据库进行检索匹配，综合色谱保留时间、前体离子精确质量数及质量误差、同位素峰分布、二级碎片离子、数据库匹配结果和文献报道等信息，对候选化合物进行初步鉴定；

18、4）相关文献查找、代表性化合物选取及裂解规律推导：在上述初步鉴定的基础上，根据化合物的精确质量数、分子式、特征碎片离子及保留时间等信息检索相关文献，并将实测二级质谱与文献报道的裂解规律进行比对；在总离子流图中选取峰强度较高、分离度良好的代表性化合物，对其二级质谱中的主要碎片离子进行人工解析，推导可能的裂解途径，包括化学键断裂位置、重排反应、中性丢失及特征碎片离子的生成机制；通过归纳该类化合物的裂解规律，验证或补充数据库检索结果，提高结构鉴定的可靠性。

19、本发明所述的松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法，其中：步骤（1）中所述样品处理包括如下步骤：

20、将松花粉干燥后过40目筛，混匀；精密称取样品粉末1.0 g，置于三口烧瓶中，加入40 ml 80%甲醇水溶液，采用超声/微波辅助萃取45 min，萃取温度设置为45 °c，超声功率调节为340 w，微波功率调节为300 w；将萃取液冷却至室温后称量，并用80%甲醇水溶液补足损失质量；混匀后，于10 °c下以14000 r/min离心10 min，取100 μl上清液与100 μl超纯水混匀后，置于进样瓶中待测。

21、本发明松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法与现有技术不同之处在于：

22、本发明松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（uhplc-q/orbitrap hrms）技术，开展了松花粉中化学成分的快速筛查与初步鉴定。松花粉经超声/微波辅助萃取后，提取液经acquity uplchss t3色谱柱（2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm）分离，在电喷雾正、负离子模式下检测。采用全扫描-数据依赖型二级质谱扫描（full ms/dd-ms2）模式采集数据，结合保留时间、前体离子的精确质量数、同位素峰分布、二级碎片离子以及otcml中药成分高分辨质谱数据库和自建数据库检索结果进行综合判定。共初步鉴定91种候选化合物，主要包括氨基酸、糖醇、糖类、核苷及核碱基、黄酮、有机酸、萜类和其他类化合物，并分析了代表性成分的质谱裂解特征。该分析策略可为松花粉的化学成分研究和质量评价提供参考。

23、下面结合附图对本发明的松花粉气溶胶中化学成分检测及特征数据库构建方法作进一步说明。