一种简便测定糕点中丙酸及其盐含量的HPLC法的制作方法

本发明专利涉及食品检测的，具体涉及一种简便测定糕点中丙酸及其盐含量的hplc法。

背景技术：

1、丙酸盐（如丙酸钙、丙酸钠）是糕点、奶酪等食品中常用的防霉剂，能有效抑制霉菌和好气性芽孢杆菌（如枯草杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌）的生长，延长保质期。丙酸及其盐的防腐效果主要依赖于未解离的丙酸分子：在细胞外形成高渗透压，使霉菌脱水；穿透细胞壁，抑制酶活性，阻碍β-丙氨酸合成，从而阻止微生物繁殖。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（gb 2760-2024）规定糕点中丙酸及其盐的最大添加量为2.5g/kg，糕点中丙酸的测定日益成为食品安全领域关注的重点。

2、糕点中成分复杂，现有方法对糕点样品提取离心后，上清液依然非常浑浊（如图1所示），需要进一步净化，然而由于过度浑浊，在用固相萃取柱进行净化时，极易堵塞柱子导致实验无法继续进行，最终导致整个实验过程耗时过长，回收率很低且极不稳定。现有方法使用的固相萃取柱是一种聚苯乙烯/二乙烯苯亲水亲脂平衡型填料柱，该柱子为广谱净化柱，并非丙酸的特异柱，其所用的淋洗液和洗脱液对于丙酸的识别效果非常差，进一步导致了回收率的降低；现有方法对样品进行处理时，样品溶液需要用ph计对酸碱度进行调节，又增加了样品处理的繁琐度和耗时。现有方法检测丙酸时，所用的流动相只有水相，普通的c18色谱柱无法胜任，必须使用耐水性c18柱，仅此一项成本就升高20%，且效果不稳定。因此急需建立一种简单方便、经济实用的糕点中丙酸的高通量检测方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的上述问题，本发明旨在提供一种简便测定糕点中丙酸及其盐含量的hplc法。

2、本发明的技术方案为：

3、一种简便测定糕点中丙酸及其盐含量的hplc法，包括步骤如下：

4、（1）样品制备：样品经粉碎机或组织捣碎机粉碎后混匀备用；

5、（2）样品处理：准确称取粉碎后的样品，加入水和磷酸溶液后混匀，提取后，加入沉淀剂后混匀，用水定容，摇匀，离心，上清液经滤膜过滤后，用hplc法检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量测定样品中丙酸的含量；

6、（3）hplc法色谱条件为: 采用c18色谱柱，流动相为甲醇+磷酸氢二铵溶液，采用紫外可见或二极管阵列检测器，波长为214nm；

7、（4）校准曲线的制作：称取丙酸纯品，用水溶解并转移至容量器中，用水定容至刻度，即得丙酸储备液；准确吸取制备好的丙酸储备液并稀释，各取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl中，分别加入磷酸，用水定容，混匀；hplc法测定，保留时间定性，外标法绘制校准曲线；

8、（5）分析结果的表述：样品中丙酸及其盐含量(以丙酸计)按式下式进行计算：

9、

x———为样品中丙酸及其盐含量(以丙酸计)，单位为克每千克(g/kg)；

10、

ρ ———由标准曲线得出的样液中丙酸的质量浓度，单位为毫克每毫升(μg/ml)；

11、

v———试样提取液定容体积，单位为毫升(ml)；

12、1000———换算系数；

13、

m ———样品质量,单位为克(g)；

14、

f ———稀释倍数。

15、进一步的，步骤（2）中，提取方法包括震荡提取或超声浸提；步骤（2）中，所述的沉淀剂为复合沉淀剂；所述加入水约20ml~25ml；所述的步骤（4）中的容量器为容量瓶或刻度离心管。

16、步骤（2）中，所述复合沉淀剂为亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液。

17、更进一步的，步骤（2）中，亚铁氰化钾溶液浓度为60-120g/l，加入体积为0.5-8ml；乙酸锌溶液浓度为100-220g/l，加入体积为0.5-8ml。

18、进一步的，步骤（2）中，亚铁氰化钾溶液浓度为70-100g/l，加入体积为1-6ml；乙酸锌溶液浓度为120-200g/l，加入体积为1-6ml。

19、具体的，步骤（2）中，亚铁氰化钾溶液浓度为92g/l，加入体积为2ml；乙酸锌溶液浓度为183g/l，加入体积为2ml。

20、优选的，步骤（2）中，震荡提取或经超声浸提时间为5min~10min；所述磷酸溶液的浓度为0.1-21 mol/l，加入体积为4ml~6ml。

21、其中，步骤（3）中hplc法色谱条件为:采用c18色谱柱；流动相为甲醇和磷酸氢二铵溶液，体积比为（5~10）:（90~95），流速为0.5~2ml/min，柱温为30-39 ℃,进样量为20-40μl，采用紫外可见或二极管阵列检测器，波长为214nm。

22、进一步的，步骤（3）中hplc法色谱条件为:采用c18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为甲醇和磷酸氢二铵溶液，体积比为5：95，流速为1.0ml/min，柱温为35 ℃,进样量为30μl。

23、具体的，校准曲线的制作：称取100mg丙酸纯品，用水溶解并转移至10ml容量瓶中，用水定容至刻度，即得10mg/ml丙酸储备液。准确吸取制备好的丙酸储备液并稀释至1000μg/ml，各取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl中，分别加入1mol/l磷酸20μl，用水定容至1ml，混匀。其丙酸标准溶液的最终浓度分别为10μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、500 μg/ml，hplc法测定，保留时间定性，外标法绘制校准曲线。

24、本发明的有益效果为：

25、（1）相较于现有方法样品处理溶液非常浑浊（如图1所示），需要固相萃取柱进行净化，前处理流程需几个小时以上的繁琐操作，本发明通过加入沉淀剂的方式对溶液进行净化、样品处理后溶液澄清（如图1所示），仅需简单过滤进行后续检测，整个前处理过程可在10分钟内完成，操作步骤极大简化，同时无需固相萃取柱的净化，成本显著降低，使得该方法简便高效，经济实惠，特别适用于市场监管、企业质控等场景下的大批量样品高通量快速筛查；

26、（2）相比于现有方法对糕点进行处理后所得样品溶液非常浑浊（如图1所示）、后续进行固相萃取柱萃取柱进行净化时，极易堵塞柱子导致实验无法继续进行，同时其使用的固相萃取柱特异性太差，回收率波动大、效率非常低等的问题，本发明通过优化有效解决了回收率极低且不稳定的问题，实现了高准确度（加标回收率101.9%~107.2%）和优异的重现性（rsd 0.9%~1.4%）；

27、（3）相较于现有方法需要调节样品溶液的ph，并经ph计对其进行测定，以使溶液ph为3左右的复杂操作，本发明通过调节磷酸溶液与沉淀剂的配比，使得样品溶液的最终ph为3左右，省略了调节ph的复杂操作，减少了样品处理的步骤；

28、（4）相比于现有方法采用磷酸氢二铵水溶液作为流动相导致普通c18色谱柱不适用，需要使用耐水性c18柱的问题，本发明以甲醇和磷酸氢二铵溶液为流动相，普通c18色谱柱即可适用，且运行稳定可靠，仅此一项成本便降低的20%；普通c18色谱柱在5%以上的甲醇水体系中才能稳定存在，同时如果继续提高甲醇的比例会导致丙酸测定时出峰时间提前，不利于丙酸和杂质的分离，因此5%的比例是最合适的。

29、（5）相较于现有方法在样品处理时需要用到50ml容量瓶，样品溶液非常脏导致后续容量瓶洗刷非常困难，本发明使用一次性50ml带刻度的离心管即可满足要求，大大方便了样品的处理；现有方法在配制校准曲线各个浓度点时，也需要使用容量瓶，操作非常繁琐，本发明用移液器解决了这一问题，进一步简化流程，方便快捷的同时精度不减。