一种用于呼气中生物活性分子在线检测装置和质谱方法

本发明涉及一种用于呼气中生物活性分子在线检测的流量调控型复合电离质谱方法，仅通过气体流量和放电电流的调节，就能够实现多种复合电离模式，同时满足从非极性到极性化合物、从低质量挥发物到蛋白大分子的离子化，结合靶向质谱分析能够在线检测人体呼气中的氨基酸、核苷酸、肉碱、多胺、三羧酸循环相关有机酸等大量的生物活性成分。

背景技术：

1、呼气分析作为一种非侵入性的检测方法，提供了对人体代谢物及其代谢过程探究的新途径，在临床诊断和各种生理、病理监测方面获得了广泛的关注。截止目前，已有多种呼吸分析测试技术被fda批准用于临床诊断，包括诊断幽门螺杆菌感染、covid-19感染、哮喘、新生儿黄疸、部分胃肠道疾病和监测心脏移植排斥等。在过去的几十年里，随着分析技术的进步，在线呼气分析逐步成为一种有潜力的技术发展方向，该方法能够动态的追踪人体实时的生理变化，并最大限度地降低样品污染和降解的风险。

2、迄今为止，在人的呼吸中已检测到的成分近千种，然而这些成分以挥发性物质为主，大部分都不具有生物活性，与常规的血液检测指标也没有直接关联，难以直接反映人体的健康状况。2007年，陈焕文课题组提出了一种电喷雾萃取电离(eesi)质谱法，可以实时分析呼出物中的一些非挥发性成分，如葡萄糖、谷氨酸和肌酐等。此外，二次电喷雾电离(sesi)质谱法作为类似的方法也适用于一些生物活性代谢物，包括几种氨基酸和三羧酸循环性相关的部分有机酸。尽管如此，对呼气冷凝液(ebc)的检测研究显示，人体呼出的气溶胶中存在的生物活性成分远不止于此，这些物质目前都无法通过在线检测的方式测得。对于这一问题，可能原因主要取决于两方面：一方面，大多数生物活性代谢物是非挥发性成分，在呼吸样本的转移过程中很容易丢失；另一方面，这些在呼吸中含量极低的成分需要合适的电离方法来提供更高的质谱检测灵敏度。eesi和sesi等在线质谱方法具备较高的灵敏度，但不能够耐受大流量的进样，且容易受到喷雾溶剂中各种基质效应的影响。相比之下，基于等离子体的电离方法对高流速和基质效应具有更好的耐受性，似乎是一种可行的电离途径。大气压电晕放电(apci)，是第一种用于在线呼吸分析的基于等离子体的电离技术。然而，用于在线呼气分析的apci-ms已多次报道，测量的成分均为挥发物。zenobi等人开发了一种用于实时呼吸分析的毛细管等离子体电离方法，该方法基于介质阻挡放电等离子体原理，检测到的化合物仍然是具有中弱极性的小分子。直接实时分析(dart)电离和低温等离子体(ltp)电离也可用于呼吸挥发物的在线分析。上述等离子体电离方法均显示出mw低于m/z 400的呼吸组分。尽管如此，值得注意的是，在这些研究中，通过等离子体的气体保持在相对较低的流速(<10l/min)。高气体流速对等离子体变化的影响也没有深入研究。

3、综上所述，目前对呼气中活性成分进行在线检测能力十分有限(<10种)，能够检测到的种类十分有限，难以向临床转化。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种能够在线检测人体呼气中的生物活性分子在线检测的质谱方法。

2、本发明仅通过气体流量和放电电流的调控，就能够实现多种形式的复合电离效应，结合靶向质谱分析方法能够检测到人体呼气中全部20种蛋白质组成氨基酸、三羧酸循环相关有机酸、部分非必需氨基酸、核苷酸、肉碱、辅酶、多胺等生物活性成分。这些生物活性分子能够直接调节生理功能或参与其他生命系统活动，部分成分也作为血液指标被应用于临床诊断，在线检测这些成分能够大大提升在线呼气分析向临床转化的潜力。

3、本发明采用的技术方案如下，具体的方法流程如附图1所示。

4、一、一种用于呼气中生物活性分子在线检测的装置：

5、装置包括进样管路、离子源腔体、玻璃纤维束、干燥气管路和放电针；进样管路水平布置，进样管路输出端伸入到离子源腔体内并且在输出端的端口内填塞有玻璃纤维束，玻璃纤维束末端露出进样管路输出端并靠近离子源腔体内的质谱入口布置，质谱入口的上方设置有干燥气管路，干燥气管路经质量流量计和离子源腔体外的中性气体罐连通，中性气体罐内存储有加热中性气体，质谱入口的前方设置有放电针。

6、所述进样管路一端作为输入端用于接收动物的呼气样品，人体口腔可以对准输入端呼气，另一端作为输出端设置为逐渐向外口径缩小的喇叭形。

7、所述放电针正对质谱入口并位于同一平面上，且所述放电针和质谱入口的中心轴线位于同一水平直线上，干燥气管路垂直正交于质谱入口与放电针所在平面，所述玻璃纤维束末端露出进样管路输出端并高于质谱入口的中心轴线但靠近离子源腔体的质谱入口布置。

8、所述放电针连接到外部的恒流电源。

9、所述的呼气样品从进样管路进入，并经过玻璃纤维束后流出，中性气体罐内存储的加热中性气体经干燥气管路后流出，放电针正对质谱入口方向进行放电，呼气样品和加热中性气体的气流在放电激励下流入到质谱入口，进而进入质谱仪中被检测。

10、所述加热中性气体具体采用氩气、氮气、氦气等。

11、所述放电针正对质谱入口，距离质谱入口的距离为0.2～1.0cm。

12、二、一种用于呼气中生物活性分子在线检测的流量调控型复合电离质谱方法，方法包含以下步骤：

13、所述的呼气样品包含了气溶胶和呼出的气体。

14、(1)所述呼气样品中的气溶胶通过进样管路进入离子源腔体内，并流出进样管路输出端被玻璃纤维束吸附；

15、(2)利用加热中性气体和放电针进行配合控制，在不同气体流量和放电电流控制条件下，以不同的电离方式对玻璃纤维束吸附的呼气样品气溶胶中的成分产生声波雾化电离效应处理，即使得气溶胶及其中的成分成中性液滴并带上电，并对其中不同的检测成分分别进行独立的不同离子化，使得电离作用不一样，使得不同特性的成分能够分离独立控制进而进入质谱入口进行质谱检测，提高质谱检测的精确性。

16、离子化的成分由于受电离，带有一定电荷，在电势能作用下进入质谱入口进行质谱检测可以通过二级质谱进行靶向检测分析，而最终离子源腔体剩余的未离子化的中性气体则会通过气泵排出。

17、所述步骤(2)具体为：然后加热中性气体从干燥气管路通入到离子源腔体内，加热中性气体对玻璃纤维束上吸附的气溶胶进行解吸附和去溶剂，使得呼气样品中的成分下落到质谱入口和放电针之间，放电针放电对下落到质谱入口和放电针之间的成分进行电离处理，形成带有成分的中性液滴并带上电而进入质谱入口被质谱检测。

18、本发明所述的超高进样流量是指高于50l/min的流量。所述流量可以是加热中性气体流出干燥气管路的一路流量和呼气样品的气流流出进样管路的一路流量的叠加，也可以是加热中性气体流出干燥气管路的独立流量。优选地为两路流量的叠加。

19、所述放电针为恒流放电针。

20、所述步骤(2)中，按照以下方式对气体流量和放电电流大小进行调控，形成不同的电离方式，电离不同的成分：

21、在气体流量为0.5l/min～10l/min、放电电流为0.1μa～5μa条件下，为大气压电晕放电模式，此时适用于辛醇-水分配系数在-2

22、在气体流量为0.5l/min～10l/min、放电电流高于15μa条件下，为火花放电模式，此时适用于辛醇-水分配系数logp>2的非极性且分子量低于200的小分子成分电离；

23、在气体流量高于50l/min、放电电流高于15μa的条件下，为大气压辉光放电协同声波喷雾复合电离模式，此时适用于辛醇-水分配系数logp<0的中等极性和强极性且分子量低于1000、大于等于200的中等质量分子的电离；

24、在气体流量高于50l/min、放电电流为0.1μa～5μa的条件下，为大气压电晕放电协同声波喷雾复合电离模式，此时适用于辛醇-水分配系数logp<0的中等极性和强极性且分子量大于等于1000大分子成分的电离。

25、所述气体流量是加热中性气体流出干燥气管路的一路流量和呼气样品的气流流出进样管路的一路流量的叠加，所述放电电流为流经放电针的电流。

26、由此通过本发明的装置配合控制方法，能够检测到人体呼气中全部20种蛋白质组成氨基酸、三羧酸循环相关有机酸、部分非必需氨基酸、核苷酸、肉碱、辅酶、多胺等生物活性成分，并且能精细分为四种情形。

27、所述方法利用气流量调控大气压下的放电形式，进而改变电离机制，在大气压电晕放电电离、辉光放电电离与火花放电电离之间进行转换，并复合了高流量引起的声波激发/喷雾电离效应，仅通过调节气体流量与放电针电流，就能够实现大气压电晕放电、火花放电、声波喷雾电离三种单一电离模式，以及电晕放电协同声波喷雾复合电离、辉光放电协同声波喷雾复合电离两种复合电离模式，性能覆盖从小分子挥发物到蛋白大分子的电离和检测，具备宽极性、大质量范围、高通量、高灵敏度和低基质效应的特点，通过该方法能够在线检测呼气中大量的生物活性成分，包括20种常见氨基酸、部分非蛋白氨基酸、部分核苷酸、肉碱、辅酶、多胺及其相关衍生物/中间体。

28、本发明具有的有益效果：

29、(1)本发明能够在线检测人体呼气中大量的生物活性分子(>80种)，远超现有的在线呼气分析技术对生物活性分子检测的覆盖范围，如eesi(谷氨酸、肌酐)，sesi(10种氨基酸，6种三羧酸循环有机酸)，该发明极大提升了呼气分析在临床诊断应用中的潜力和转化价值。

30、(2)本发明中的流量调控型复合电离质谱方法仅通过流量和放电电流的调节，就能够同时实现多种复合电离模式，满足从极性分子到非极性分子、从挥发性小分子到蛋白大分子的检测需求，可适用化合物的极性范围宽、质量范围大。相比之下，现有的各种商用质谱方法需要切换不同的离子源模块或者配件，才能够实现上述特点。

31、(3)本发明能够在线独立分离地检测人体呼吸中众多生物活性成分，为呼吸分析替代一些血液检查项目提供了可能性，极大的提升了呼气分析在临床诊断中的潜力和转化价值。