基于褐飞虱气味结合蛋白NlugOBP9的吡蚜酮检测方法及传感器

本发明属于农药检测领域，更具体的涉及一种基于褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的吡蚜酮检测方法及传感器。

背景技术：

1、吡蚜酮（pymetrozine）是一种新型吡啶类杀虫剂，通过靶向昆虫弦音器中的瞬时受体电位香草酸通道（trpv），干扰昆虫的神经和肌肉功能，抑制取食和繁殖行为，最终导致昆虫死亡。然而，随着吡蚜酮在田间应用的加剧，其环境残留问题日益突出，对水生态环境和农产品安全构成潜在威胁。因此，建立快速、灵敏、便捷的吡蚜酮残留检测方法，对于环境监测和食品安全保障具有重要的现实意义。

2、目前，吡蚜酮残留检测主要采用液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱联用法等仪器分析方法。该类方法虽然灵敏度和准确性较高，但通常需要昂贵的仪器设备、专业的操作人员以及复杂的样品前处理过程，检测周期长、成本高，难以满足现场快速检测的需求。基于抗原-抗体特异性识别的免疫检测方法（如酶联免疫吸附测定法和胶体金免疫层析法）在一定程度上弥补了上述不足，但抗体的制备周期长、成本较高，且对化学环境敏感，在复杂基质中的稳定性有待改善。因此，开发新型、稳定的吡蚜酮识别元件及相应的快速检测技术具有重要的应用价值。

3、昆虫依赖高度灵敏的嗅觉系统来特异性检测和区分数千种化学气味分子，从而调节寄主定位、交配和产卵等关键行为。这一嗅觉识别过程依赖于感觉淋巴液中气味分子的溶解和转运，主要由气味结合蛋白（odorant-binding proteins, obps）和化学感受蛋白（chemosensory proteins, csps）介导。近年来研究表明，除结合寄主植物挥发物外，obps和csps还能与多种化学农药相互作用，与昆虫抗药性形成密切关联。obps和csps能够结合结构多样的化合物，这一特性不仅有助于抗性的发展，还为其作为基于蛋白质的生物识别元件用于农药检测平台提供了理论基础。

4、与传统识别元件（如抗体或膜受体）相比，obps具有多重优势：可通过原核表达系统高效大量生产，并可通过简单的色谱方法纯化，具有成本效益和操作便利性；obps具有显著的稳定性，在可变温度、ph条件甚至蛋白酶存在下仍能保持结构和功能，从而在挑战性环境中维持活性。这些稳健性特征使obps能够与多种传感器转导平台兼容，包括电化学、光学和场效应晶体管系统。然而，obps在农药检测中的应用仍相对有限，需要进一步探索其在农化监测中的潜力。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种基于褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的吡蚜酮检测方法及传感器。本发明基于转录组分析和功能验证，发现nlugobp9与褐飞虱吡蚜酮抗性密切相关；利用分子对接、荧光猝灭和表面等离子体共振分析证实nlugobp9与吡蚜酮具有特异性结合能力。基于此，本发明构建了基于nlugobp9的mzi光纤传感器和胶体金侧流层析试纸条，实现了对吡蚜酮的高灵敏、高选择性检测。

2、本发明首先提供了一种利用褐飞虱气味结合蛋白检测吡蚜酮的方法，其包括以下步骤：将褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9固定在固相载体上，使待测样品与固相载体上的褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9接触，检测nlugobp9与待测样品中吡蚜酮结合所产生的可检测信号，根据所述可检测信号的强度判断待测样品中吡蚜酮是否存在或确定其含量；所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、根据本发明的优选方案，所述固相载体为光纤，所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9固定于光纤的传感区域表面，所述可检测信号为所述光纤传输的光信号变化。

4、根据本发明的优选方案，所述光纤为马赫-曾德尔干涉仪光纤，所述马赫-曾德尔干涉仪光纤通过将第一单模光纤、第二单模光纤和第三单模光纤依次偏芯熔接构成，其中所述第二单模光纤作为传感区域，所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9固定于所述第二单模光纤的表面；所述光信号变化为干涉光谱的强度变化。

5、根据本发明的优选方案，所述固相载体为侧流层析试纸条；所述侧流层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9与胶体金偶联形成nlugobp9-胶体金偶联物，nlugobp9-胶体金偶联物喷涂于侧流层析试纸条的结合垫上，所述可检测信号为试纸条检测线的颜色信号。

6、根据本发明的优选方案，所述检测线上包被有吡蚜酮-牛血清白蛋白偶联物，检测时，待测样品中游离的吡蚜酮与所述检测线上的吡蚜酮-牛血清白蛋白偶联物竞争结合所述nlugobp9-胶体金偶联物中的nlugobp9蛋白，所述检测线的颜色强度反映待测样品中吡蚜酮含量。

7、根据本发明的优选方案，所述待测样品为农业环境水样，所述农业环境水样可以为稻田水、田间径流水或灌溉水等。

8、根据本发明的优选方案，所述方法的检测限为0.01ng/ml至5ng/ml。

9、本发明进一步提供了褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9在检测吡蚜酮中的应用，所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的氨基酸序列如seq id no.2所示。进一步的，所述应用过将褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9作为检测标志物。进一步的，所述应用利用nlugobp9与吡蚜酮的特异性结合能力，通过检测nlugobp9与吡蚜酮结合引起的可检测信号的变化实现待测样品中吡蚜酮的检测。其中，待测样品的形式优选为液体样品，例如可以为水样。考虑到吡蚜酮主要作为杀虫剂使用，因此，可以直接将农业环境水样作为待测样品。

10、本发明进一步提出了一种基于褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的吡蚜酮检测用光纤传感器，所述光纤传感器由第一单模光纤、第二单模光纤和第三单模光纤偏芯熔接构成，所述第二单模光纤作为传感区域；第二单模光纤的表面经过羟基化处理、硅烷化处理和戊二醛交联处理，所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9通过戊二醛交联共价固定于所述第二单模光纤的表面；所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的氨基酸序列如seq id no.2所示。

11、本发明还提出了一种基于nlugobp9的吡蚜酮检测用侧流层析试纸条，其包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接并固定于衬板上，所述结合垫上喷涂有nlugobp9-胶体金偶联物；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上包被有吡蚜酮-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线上包被有抗鼠igg抗体；所述褐飞虱气味结合蛋白nlugobp9的氨基酸序列如seq id no.2所示。

12、本发明进一步提供了所述的光纤传感器或所述的侧流层析试纸条在检测农业环境水样中吡蚜酮残留中的应用。

13、本发明的实验结果表明：

14、（1）本发明首次发现褐飞虱来源的气味结合蛋白nlugobp9能够与吡蚜酮发生特异性结合，spr结合分析显示nlugobp9与吡蚜酮的结合亲和力（kd = 5.28×10-6m）显著优于其对毒死蜱的亲和力（kd = 3.69×10-5m），表明nlugobp9对吡蚜酮具有良好的识别特异性。分子对接分析显示，吡蚜酮可占据nlugobp9的疏水结合口袋，与leu-24、his-54、phe-65、ile-66、phe-70和phe-129等残基相互作用，his-54形成氢键，结合自由能为-6.91 kcal/mol，表明nlugobp9对吡蚜酮具有较强的预测亲和力。

15、（2）本发明基于nlugobp9蛋白构建的马赫-曾德尔干涉仪光纤传感器，对吡蚜酮的检测限低至0.01 ng/ml，检测范围为0.01-100 ng/ml，且对毒死蜱、烯啶虫胺和吡虫啉等常见农药无明显响应，具有高度选择性。

16、（3）本发明基于nlugobp9蛋白构建的胶体金侧流层析试纸条，视觉检测限为5 ng/ml，计算检测限为0.82 ng/ml，在低浓度下信号衰减优于商业化吡蚜酮检测试纸条。

17、（4）nlugobp9蛋白可通过原核表达系统高效制备，生产成本低、批次一致性好，避免了传统抗体识别元件制备周期长、成本高、稳定性差等问题。

18、（5）田间水样检测验证表明，本发明的两种传感器均能成功检测施药后0、24、48、72 h的田间水样中的吡蚜酮残留，mzi传感器在超过1 km的光纤传输距离下仍保持稳定检测性能。两者对田间实际水样的检测结果一致，验证了本发明技术方案在实际应用中的可行性和可靠性。