盐酸溴己新中NDMA和NDEA基因毒杂质的检测方法与流程

本发明涉及药物杂质检测，具体涉及盐酸溴己新中ndma和ndea基因毒杂质的检测方法。

背景技术：

1、盐酸溴己新片为otc甲类非处方祛痰药，属于基本药物及医保工伤用药，适用于慢性支气管炎、哮喘等疾病引发的粘痰咳出困难症状。原料药盐酸溴己新的起始原料可能引入dmf、二丙胺，中间体存在亚胺结构或含亚胺结构的副产物。因此盐酸溴己新片中可能存在致突变杂质n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙基乙酰胺(ndea)，ndma和ndea均属于2a类致癌物质，为致突变性高、致癌性强的基因毒性杂质，严重危害人体健康。根据国际药品监督机构(fda、ema、who等)发布的亚硝胺杂质相关技术要求和持续更新的亚硝胺杂质清单信息，ndma和ndea的每日可接受摄入量(ai)分别为96ng/天和26.5ng/天，按照盐酸溴己新片制剂最大日剂量48mg计算，ndma和ndea的限度分别为2ppm和0.55ppm。

2、在基因毒杂质检测领域，现有技术虽已围绕单一杂质(如ndma、ndea)开发了多种检测方法，目前关于ndma和ndea的检测主要有hplc-ms和gc-ms法。盐酸溴己新尚未建立一种能够同时检测ndma和ndea的多组分同步分析技术，因此为保障后续产品的质量可控，研发一种可同时检测盐酸溴己新中痕量ndma、ndea且保证ndma、ndea稳定准确检出的方法是十分必要的，且开发兼顾高灵敏度、高稳定性和多组分同步检测能力的基因毒杂质分析方法，是当前药物质量控制领域亟待解决的技术瓶颈。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供了盐酸溴己新中ndma和ndea基因毒杂质的检测方法，可以同时检测盐酸溴己新中痕量ndma、ndea且保证ndma、ndea检测的稳定准确性。

2、具体而言，本发明提供一种盐酸溴己新中基因毒杂质ndma、ndea 的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

3、将盐酸溴己新溶解于稀释剂（空白溶液）（量取250 ml乙醇至试剂瓶中，加入250ml二氯甲烷，加入2.5 μl ndma-c13-d6，混匀，即得）；

4、采用气相色谱-质谱联用仪进行检测，所述色谱条件为：

5、本发明使用三重四级杆气质联用仪：7000d gc/tq-8890 gc（agilent）；

6、使用色谱柱（agilent, db-624ui, 30 m×0.25 mm×1.4 µm），载气为氦气；

7、进样口温度200℃，柱流速1.0ml/min，进样量1ul，不分流；

8、程序升温程序为：起始温度45℃保持0.5min，以25℃/min速率升至220℃；

9、后运行 250℃保持3min（2ml/min）；

10、所述质谱条件为：

11、检测器为ms/ms，离子源为ei源，离子源温度为250℃，四级杆温度为1/2为150℃，传输线温度为250℃，采集模式选择mrm模式。

12、在本发明的优选的实施方式中，乙醇（cinc）hplc级别；二氯甲烷（cinc）hplc级别hplc级别。

13、在本发明的优选的实施方式中，所述供试品的浓度为10mg/ml。

14、在本发明的优选的实施方式中，色谱柱条件为进样口温度200℃，流速为1.0ml/min，进样量为1ul，进样模式为不分流；柱流速1.5ml/min、色谱柱的起始温度为60℃，色谱柱的程序升温条件为：60℃起始保持1min，以30℃/min速率升至260℃，保持1min；

15、升温程序为：起始温度45℃保持0.5min，以25℃/min速率升温至220℃；后运行250℃保持3min（2ml/min）；

16、在本发明的优选的实施方式中，所述质谱条件还包括以下mrm离子对：

17、ndma的定量离子对为m/z74/42、碰撞能20ev；ndea的定量离子对为m/z102/85、碰撞能10ev；所述mrm驻留时间为80ms，溶剂延迟时间为4.5min，质谱分辨率为unit/unit。

18、在本发明的优选的实施方式中，稀释剂（空白溶液）：量取250 ml乙醇至试剂瓶中，加入250 ml二氯甲烷，加入2.5 μl ndma-c13-d6，混匀，即得。

19、在本发明的优选的实施方式中，供试品溶液：称取供试品约90~110 mg至10 ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，混匀，即得。

20、本发明的另一目的在于提供本发明ndma、ndpa残留量的检测方法用于化学小分子药物或多肽药物的质量控制中的应用。

21、本发明的优选技术方案中，所述化学药物选自原料药或其制剂中推测可能含有亚硝胺结构的药物。

22、本发明提供了一种ndma、ndea的检测方法，该方法采用气相色谱-质谱法，色谱柱为毛细管柱，质谱离子源为ei源。对照品和样品经稀释剂（量取250 ml乙醇至试剂瓶中，加入250 ml二氯甲烷，加入2.5 μl ndma-c13-d6，混匀，即得）溶解，气相色谱质谱联用仪进行检测。

23、本发明的核心技术方案为采用 gc-ms 联用技术，通过优化色谱柱、柱温程序、质谱参数及样品前处理方法，实现四种杂质的同时分离与定量。其中：色谱柱为毛细管柱，质谱离子源为ei源。对照品和样品经稀释剂（量取250 ml乙醇至试剂瓶中，加入250 ml二氯甲烷，加入2.5 μl ndma-c13-d6，混匀，即得）溶解，气相色谱质谱联用仪进行检测。

24、具体包括以下优势：本发明方法能同时对基因毒杂质ndma和ndea进行检测，本方法采用气相色谱-质谱联用技术（gc-ms），实现两种杂质的高效同步检测。色谱条件简单，质谱检测限优异，方法显著提升了杂质稳定性，回收率rsd值均< 20% ，该方法检测专属性好、精密度高，从而实现对盐酸溴己新中基因毒杂质的有效控制，有利于保障药品的质量，进而保障临床用药的安全性，具有显著的技术优势和工业应用价值。

1.盐酸溴己新中ndma和ndea基因毒杂质的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释剂的配制方法为：量取250 ml乙醇和250 ml二氯甲烷至试剂瓶中，加入2.5µlndma-c13-d6，混匀即得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为10 mg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件还包括溶剂延迟时间为4.5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mrm模式的离子对条件为：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mrm模式的驻留时间为80ms，质谱分辨率为单位质量分辨率。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制对照品溶液的步骤，所述对照品溶液中含有ndma和ndea，以所述对照品溶液作为外标，采用内标法计算供试品溶液中ndma和ndea的含量。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述程序升温条件还包括后运行条件：250℃保持3 min，柱流速为2 ml/min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法对ndma的检测限为0.090 ppm，定量限为0.18 ppm；对ndea的检测限为0.025 ppm，定量限为0.050 ppm。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于盐酸溴己新原料药或盐酸溴己新制剂中基因毒杂质ndma和ndea的质量控制。