一种评价STAT6PROTAC化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的方法及其应用与流程

本发明属于分析化学，涉及一种评价stat6 protac化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的方法及其应用。

背景技术：

1、stat6（信号转导及转录激活蛋白6）是2型免疫反应的关键转录因子，在过敏性哮喘、特应性皮炎等免疫相关疾病的发病机制中发挥重要作用。stat6的异常活化与th2细胞分化、ige类别转换及炎症因子的释放密切相关，因此stat6已成为自身免疫性疾病和过敏性疾病的重要治疗靶点。

2、目前，靶向stat6的protac（蛋白降解靶向嵌合体）降解剂是药物研发的热点方向之一。在药效评价过程中，常使用人外周血单个核细胞（pbmc）作为体外模型，通过检测stat6蛋白水平的变化来评估化合物的降解活性。

3、现有技术中，stat6降解活性的检测主要采用western blot方法。该方法将pbmc与待测化合物共孵育后裂解细胞，提取总蛋白，通过sds-page电泳分离蛋白并转移至膜上，利用stat6特异性抗体进行免疫印迹检测，依据条带灰度值计算stat6蛋白的相对表达水平。

4、然而，该方法存在以下不足：第一，无法区分免疫细胞亚群。pbmc包含t细胞、b细胞、单核细胞等多种免疫细胞亚群，不同亚群在疾病发病机制中扮演着不同的角色，其stat6的基础表达水平和药物响应性可能存在差异。western blot检测的是细胞群体裂解后的平均蛋白水平，无法揭示stat6在不同疾病相关亚群中的选择性降解情况。

5、第二，通量和效率低。western blot涉及蛋白提取、电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显影等多个操作环节，步骤繁琐、耗时长，难以满足药物筛选过程中大量候选化合物、多个浓度点的平行检测需求。

6、第三，所需细胞数量多。western blot通常需要较大数量的细胞样品，对于来源有限的临床样本或高通量筛选早期阶段的化合物评价而言，明显限制了实验的可行性和检测通量。

7、因此，本领域亟需一种能够高通量、精准评估protac降解剂对不同pbmc免疫细胞亚群中stat6降解活性的检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种评价stat6 protac化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的方法及其应用。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种评价stat6 protac化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的方法，所述方法包括：

4、（1）将外周血单个核细胞使用低吸附培养板进行铺板，分别设置阴性对照组和待测化合物组，待测化合物组中加入经梯度稀释的待测protac化合物，阴性对照组中加入不含待测化合物的溶剂，各组在相同条件下孵育；

5、（2）向培养板中各组样品加入细胞活性检测染料和fc受体阻断剂进行孵育，进行死活细胞标记和fc受体封闭；

6、（3）向各组培养板中加入抗cd14抗体和抗cd19抗体进行孵育，随后依次进行固定、破膜；

7、（4）向各组培养板中加入抗cd3抗体和抗stat6抗体进行孵育；

8、（5）孵育结束后用流式细胞仪收集各样品的细胞，分析cd14+单核细胞、cd19+b细胞和cd3+t细胞各自的stat6荧光强度，计算待测化合物对各免疫细胞亚群stat6的降解活性。

9、stat6 protac化合物为具有stat6降解活性的protac化合物，本发明创造性地提出一种评价stat6 protac化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的方法，使用表面标记（cd3、cd14、cd19）与细胞内stat6染色相结合的多参数流式方案，可以实现混合细胞群中不同亚群的stat6单细胞水平定量；同时本发明在检测过程中，针对pbmc优化了固定与破膜流程（如固定与破膜的顺序），可以兼顾细胞内转录因子检测与表面抗原完整性。本发明对各免疫细胞亚群分别设门分析stat6水平并计算dc50，可以更好地评估protac的细胞亚群降解能力。

10、优选地，步骤（1）所述低吸附培养板包括低吸附96孔u型板。

11、优选地，步骤（1）所述铺板的密度为30-50万细胞/孔（例如可以是30万细胞/孔、35万细胞/孔、40万细胞/孔、45万细胞/孔、50万细胞/孔等）。

12、本发明精确控制细胞的铺板密度，避免了由于铺板密度过低导致操作过程中因破膜及多次清洗导致细胞大量丢失的现象。

13、优选地，步骤（1）所述梯度稀释的稀释比例为1:（2-4）（例如可以是1:2、1:3、1:4等），一共9-12个浓度点（例如可以是9个、10个、11个、12个等）。

14、优选地，步骤（1）所述孵育的温度为35-40℃（例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等），时间为20-28 h（例如可以是20 h、22 h、24 h、26 h、28 h等），二氧化碳浓度为3-7%（例如可以是3%、4%、5%、6%、7%等）。

15、优选地，步骤（2）所述孵育的温度为2-8℃（例如可以是2℃、4℃、6℃、8℃等），时间为10-20 min（例如可以是10 min、12 min、14 min、16 min、18 min、20 min等）。

16、优选地，步骤（3）所述孵育的温度为2-8℃（例如可以是2℃、4℃、6℃、8℃等），时间为25-40 min（例如可以是25 min、30 min、35 min、40 min等）。

17、优选地，步骤(3)中所述抗cd14抗体偶联的荧光素为bv510荧光素，所述抗cd19抗体偶联的荧光素为alexa fluor 488荧光素。

18、流式细胞术检测中，破膜液（如perm buffer iii）会对蛋白质类荧光团造成较大损伤，导致荧光信号衰减甚至丧失，从而影响检测结果的准确性和可靠性。因此，在选择用于细胞表面染色的抗体荧光素时，需要选用能够耐受固定/破膜处理、在该条件下仍能保持良好荧光稳定性的荧光素。本发明中选用的bv系列（如bv510）和alexa fluor系列（如alexafluor 488）均属于非蛋白质类荧光团，在固定/破膜处理后仍能保持稳定的荧光强度，满足本方法对荧光信号稳定性的要求。

19、优选地，步骤（3）所述固定的方式为：将细胞重悬后，向培养基中加入固定液，在35-40℃（例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等）下孵育5-20 min（例如可以是5、10、15、20 min等）。

20、优选地，步骤（3）所述破膜的方式为：向培养板中加入破膜液，在0-4℃（例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃等）下孵育20-40 min（例如可以是20 min、25 min、30 min、35min、40 min等）。

21、优选地，步骤（3）所述破膜后，还包括加入1.5-3倍（例如可以是1.5倍、2倍、2.5倍、3倍等）体积的染色缓冲液终止反应的步骤。

22、优选地，步骤（4）所述孵育的条件为20-30℃（例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等），时间为50-70 min（例如可以是50 min、55 min、60 min、65 min、70 min等）。

23、优选地，步骤（4）中所述抗cd3抗体偶联的荧光素为bv605荧光素，所述抗stat6抗体偶联的荧光素为alexa fluor 647荧光素。

24、优选地，步骤（4）中所述stat6抗体的工作稀释度为1:（4-6）（例如可以是1:4、1:5、1:6等）。

25、在上述稀释度范围内，抗体能够高效识别胞内stat6蛋白，确保阳性信号的检出率，同时有效降低非特异性结合背景，获得最大的染色窗口和清晰的分群效果。

26、优选地，步骤（5）中用流式细胞仪每个样品收集1.5万-2.5万个细胞（例如可以是1.5万、2万、2.5万等）。

27、上述所涉及的所有数值范围内未一一列举的其他具体点值均可选择，均在本发明的保护范围内，考虑到表述简要，在此不再一一赘述。

28、第二方面，本发明提供如第一方面所述的方法在检测stat6 protac化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的应用。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、本发明创造性地提出一种评价stat6 protac化合物在不同免疫细胞亚群中降解活性的方法，使用表面标记（cd3、cd14、cd19）与细胞内stat6染色相结合的多参数流式方案，可以实现混合细胞群中不同亚群的stat6单细胞水平定量；同时本发明在检测过程中，针对pbmc优化了固定与破膜流程（如固定与破膜的顺序），可以兼顾细胞内转录因子检测与表面抗原完整性。本发明对各免疫细胞亚群分别设门分析stat6水平并计算dc50，可以更好地评估protac的细胞亚群降解能力。