一种用于检测肠炎沙门氏菌的可视化分子印迹传感器

本发明属于食品安全检测，具体涉及一种用于检测肠炎沙门氏菌的可视化分子印迹传感器。

背景技术：

1、食源性病原菌肠炎沙门氏菌（salmonella enteritidis）是全球范围内导致食源性疾病的主要病原体之一，已被世界卫生组织列为国际公共卫生重点监控对象。实现对该病原体的快速、灵敏且特异的早期诊断，是保障食品安全和进行有效公共卫生防控的关键。传统培养法作为检测“金标准”，结果可靠但耗时3-5天，难以满足快速检测需求。免疫学检测法（如elisa）操作相对简便，是目前沙门氏菌筛查的常用手段之一。例如，基于鞭毛蛋白flic的间接elisa法与商品化试剂盒的符合率可达94.1%，体现出较好的应用潜力。然而，该类方法仍存在固有局限：依赖抗体质量、存在交叉反应风险、耗时长、灵敏度有限、无法区分死菌与活菌，且易受复杂基质干扰。分子生物学方法发展迅速，pcr技术可实现基因水平的快速检测，多重pcr可同时检测多种致病菌。近年来crispr-cas、数字pcr及微流控等新技术不断涌现，但仍面临操作繁琐、场景适应度低等挑战。因此，开发一种检测成本低、选择性好、灵敏度高、快速可视化的细菌检测方法备受期待。

2、分子印迹技术（molecular imprinting technology, mit）因其能够制备具有特定识别位点的聚合物，且具备结构可预测性、识别特异性和优异的物理化学稳定性，在病原微生物检测领域展现出巨大潜力。近年来，研究者已尝试将分子印迹聚合物（molecularlyimprinted polymers, mips）应用于沙门氏菌检测。例如，有研究以沙门氏菌外膜特征成分脂多糖（lps）为印迹模板，构建聚多巴胺基分子印迹电化学传感器，避免了活菌操作的同时实现了10 cfu/ml的灵敏检测[lee s, kim h, kim m, et al. rapid and simple on-site salmonella detection in food via direct sample loading using alipopolysaccharide-imprinted polymer [j]. journal of nanobiotechnology, 2025,23: 279. ]然而，现有mips传感器大多依赖荧光或电化学信号输出，仍需要专业仪器读取结果，难以实现真正的现场即时可视化检测。

3、基于此，本发明将分子印迹技术的高选择性识别能力与酸裂解zif-8释放zn²⁺诱导金纳米粒子（aunps）聚集的可视化信号放大策略相结合。以fe3o4@sio2@c=c为（即表面修饰有碳碳双键的fe3o4@sio2）载体、肠炎沙门氏菌为模板，通过表面自由基聚合制备磁性分子印迹聚合物（mips）作为捕获单元；同时合成表面修饰对羧基苯硼酸（4-cpba）的zif-8@cpba作为信号放大探针。检测时，mips选择性捕获目标菌，经磁分离后加入zif-8@cpba，形成“mips-细菌-zif-8@cpba”三明治夹心结构；加入酸裂解zif-8，释放出大量zn2+，诱导带负电的aunps迅速聚集，溶液由红色变为蓝色，从而实现对肠炎沙门氏菌的快速、灵敏、可视化检测。

技术实现思路

1、针对现有技术中肠炎沙门氏菌检测方法操作复杂、依赖大型仪器、检测周期长且难以实现可视化现场检测等不足，本发明提供一种用于检测肠炎沙门氏菌的可视化分子印迹传感器，以实现对目标菌的高灵敏、高特异性、快速的可视化现场检测。

2、技术方案：本发明所述的一种用于检测肠炎沙门氏菌的可视化分子印迹传感器的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)以fe3o4@sio2@c=c为载体，肠炎沙门氏菌为模板分子，丙烯酰胺（am）为功能单体，n,n'-亚甲基双丙烯酰胺（mba）为交联剂，通过自由基聚合在载体表面形成印迹层。洗脱模板后，获得能特异性识别肠炎沙门氏菌的磁性mips（如图1中的a所示）。该mips可通过外加磁场实现快速分离与富集。

4、(2)合成带有氨基的zif-8（zif-8-nh2），并在其表面接枝对羧基苯硼酸（4-cpba），得到zif-8@cpba功能化材料。该材料利用苯硼酸基团在弱碱性条件下可与细菌表面脂多糖（lps）的邻二醇结构可逆形成环状酯的特性，实现对肠炎沙门氏菌的选择性识别与结合（如图1中的b所示）。

5、(3)利用磁性mips对复杂样品中的肠炎沙门氏菌进行选择性捕获，经磁分离去除基质干扰。然后，向体系中加入zif-8@cpba，在弱碱性条件下孵育，使其与已捕获在mips上的细菌表面充分结合，形成“mips-细菌-zif-8@cpba”的三明治夹心结构。通过外加磁场移除未结合的zif-8@cpba后，向富集产物中加入盐酸裂解zif-8结构，释放出大量zn²⁺。

6、(4)采用柠檬酸盐还原法合成带负电的金纳米粒子（aunps）。将步骤(3)中裂解释放的zn²⁺上清液加入aunps溶液中，zn²⁺会诱导带负电的aunps发生聚集，使其局域表面等离子体共振（lspr）性质发生变化，溶液颜色由红色迅速变为蓝色（如图1中的c所示）。颜色变化的程度与目标菌浓度相关，通过肉眼观察或紫外-可见分光光度计测定即可实现对肠炎沙门氏菌的半定量或定量检测。

7、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

8、(1)本发明利用zif-8材料作为高密度zn²⁺的信号储存器。在夹心识别后，结合于目标菌表面的zif-8@cpba经酸裂解释放zn2+，且zn2+释放量与结合的细菌数量直接相关；相较于直接添加游离zn2+，该设计实现了细菌浓度对zn2+释放量的精确调控，从而将痕量细菌的识别信号转化为与菌浓度对应的、肉眼可见的颜色变化，极大提高了检测灵敏度。实验数据证实，该传感器对肠炎沙门氏菌的检测限低至54 cfu/ml。

9、(2)本发明结合了分子印迹技术的形状/官能团识别与zif-8@cpba的硼酸亲和识别。选择性和竞争性实验说明mips对目标菌的捕获能力显著高于鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及肺炎克雷伯菌等常见干扰菌，非特异性吸附干扰得到了有效排除。这种双重识别机制确保了即使在复杂菌群背景中，也能精准锚定目标菌，极大提升了检测的选择性和抗干扰能力。

10、(3)本发明所构建的传感器具有良好的线性范围（1×10³至1×108 cfu/ml）、极低的检测限（54 cfu/ml）、良好的重现性和时间稳定性（室温放置一个月后仍保持90%以上活性），适合长期使用。

11、(4)本发明所构建的传感器适合现场快速筛查，无需大型仪器。结果通过溶液颜色变化（红色→蓝色）即可肉眼判读，非常适合食品安全现场快速检测和资源有限地区的应用。

1.一种用于检测肠炎沙门氏菌的可视化分子印迹传感器，其特征在于，所述传感器包括：磁性分子印迹聚合物mips、信号放大探针zif-8@cpba以及金纳米粒子aunps；其中，所述mips以表面修饰有碳碳双键的fe3o4@sio2为载体、以肠炎沙门氏菌为模板、以丙烯酰胺为功能单体、以n,n'-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过表面自由基聚合反应制得；所述信号放大探针zif-8@cpba以zif-8为载体，其表面修饰有对羧基苯硼酸；检测时，所述mips捕获目标菌后，与所述zif-8@cpba形成“mips-细菌-zif-8@cpba” 三明治夹心结构，经酸裂解释放zn2+，所述zn2+诱导表面带负电荷的aunps发生聚集，使溶液由红色变为蓝色，从而实现肉眼可视化检测。

2.一种检测肠炎沙门氏菌的可视化方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.一种信号放大探针，其特征在于，包括以zif-8为载体的金属有机框架材料，其表面修饰有对羧基苯硼酸，所述探针在酸性条件下裂解释放zn2+，用于诱导表面带负电荷的aunps聚集产生可视化颜色变化。

4.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述mips的制备方法包括以下步骤：

5.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述信号放大探针zif-8@cpba的制备方法包括以下步骤：

6.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述金纳米粒子aunps通过柠檬酸盐还原法制备：将100 ml质量分数为0.01%的haucl4溶液在剧烈搅拌下加热至沸，迅速加入10 ml浓度为38.8 mm的柠檬酸三钠，继续加热至溶液呈酒红色后停止反应，冷却至室温后于4 °c储存。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述mips在孵育体系中的浓度为1.0~2.5 mg/ml，优选为2.0 mg/ml；所述zif-8@cpba在孵育体系中的浓度为0.5~2.0 mg/ml，优选为1.0 mg/ml；所述孵育溶剂为pbs缓冲液；所述mips与样品的孵育时间为5~60min，优选为30 min；所述zif-8@cpba的孵育时间为5~60 min，优选为20 min；进一步优选地，当所述mips与样品的孵育时间为10 min、所述zif-8@cpba的孵育时间为6 min时，总检测时间约为16 min，适用于现场快速可视化筛查。

8.如权利要求4所述的传感器，其特征在于，步骤(2)中所述功能单体丙烯酰胺的用量为0.4~0.6 mmol，优选为0.5 mmol；所述交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为0.07~0.09 mmol，优选为0.09 mmol；所述催化剂四甲基乙二胺的用量为110~130μl，优选为110μl；所述模板菌的浓度为1×105~1×108 cfu/ml，优选为1×108 cfu/ml。

9.如权利要求4所述的传感器，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱剂为乙酸与十二烷基硫酸钠的混合溶液，其组成选自：5%乙酸、1 %十二烷基硫酸钠、5 %乙酸+1 %十二烷基硫酸钠、5 %乙酸+2 %十二烷基硫酸钠、10 %乙酸+1 %十二烷基硫酸钠、10 %乙酸+2 %十二烷基硫酸钠，优选为5 %乙酸+2 %十二烷基硫酸钠。

10. 如权利要求1所述的用于检测肠炎沙门氏菌的可视化分子印迹传感器，其特征在于，所述传感器对肠炎沙门氏菌的检测线性范围为1×10³ ~ 1×108 cfu/ml，检出限为54cfu/ml，快速检测仅需16 min。