一种基于水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器及制备方法与应用

本发明属于电化学分析，涉及一种基于液态金属复合水凝胶和多功能多肽的协同抗污染电化学生物传感器及其制备方法和应用，具体公开了一种具有优异抗污染性能和高灵敏度的电化学生物传感器，以用于唾液中白细胞介素-1β的检测。

背景技术：

1、随着个性化医疗和精准诊断的快速发展，对痕量生物标志物进行快速、灵敏且高灵敏定量分析的需求急剧增加。作为一种典型的非侵入性生物体液，唾液因其方便采集、安全性高、成本低以及便于连续监测等优势在疾病诊断领域受到广泛关注。近年来，越来越多的研究表明，唾液中含有丰富的生物标志物，包括蛋白质、核酸及外泌体，其浓度的异常变化与肺癌、乳腺癌及炎症性疾病等多种疾病密切相关。白细胞介素-1β（il-1β）作为一种典型的促炎细胞因子，主要由巨噬细胞、单核细胞及上皮细胞分泌，在调控炎症反应、免疫应答及细胞信号传导过程中发挥关键作用。当遭遇感染、组织损伤或自身免疫攻击时，il-1β会迅速生成，从而增强并维持炎症反应。il-1β的异常表达与多种病理过程密切相关，如炎症性疾病、自身免疫性疾病和癌症等。此外，il-1β是唾液中一种重要的炎症生物标志物，由唾液腺和口腔黏膜细胞分泌产生，其浓度的变化可反映局部及全身性炎症状态。因此，开发高灵敏度的唾液il-1β检测平台对于早期诊断和实时监测具有重要意义。

2、近年来，越来越多的研究表明，电化学生物传感器在痕量生物标志物检测领域展现出显著优势，这主要得益于其高灵敏度、快速响应、低成本及操作简便等特点。特别是在疾病早期阶段，生物标志物通常处于痕量水平，其浓度往往低于传统分析方法的有效检测范围。通过高效界面电子转移，电化学生物传感器能够实现对痕量目标分子的灵敏识别与超低限检测，因而在早期疾病筛查和动态监测中具有广阔应用前景。然而，在复杂生物样本中，传感界面易受到蛋白质、细胞碎片及其他生物大分子的非特异性吸附，导致界面电子传递受阻以及检测灵敏度下降，从而严重影响传感器检测的准确性和稳定性。

3、因此，构建具有优异抗污染性能的界面已成为提升电化学生物传感器在复杂生物环境中实现精准、可靠检测的关键策略。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种基于水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器及制备方法。通过构建协同抗污染界面，有效抑制复杂唾液基质中的非特异性吸附，与此同时，提高传感界面的导电性，从而提高il-1β检测的灵敏度和准确性。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明首先提供一种基于水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器，所述电化学传感器通过分步组装构建，首先在玻璃碳电极表面沉积聚(3,4-乙烯二氧噻吩)薄膜，然后将lm@cnc-pam-cs水凝胶悬浊液滴涂于聚(3,4-乙烯二氧噻吩)薄膜形成功能化水凝胶界面；最后在功能化水凝胶界面偶联多肽，获得所述水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器。

3、进一步地，所述lm@cnc-pam-cs水凝胶悬浊液制备方法如下：

4、将100 mg液体金属加入2 ml、0.2 wt%的纤维素纳米纤维水溶液中，在冰水浴下超声处理30分钟，得到均匀分散的lm@cnc纳米颗粒悬浮液；随后，将壳聚糖在1%乙酸中搅拌溶解，制备出2 mg ml-1的壳聚糖溶液；接着，向lm@cnc纳米颗粒悬浮液中加入1.5 g丙烯酰胺，并进行20分钟超声处理；之后加入制备的壳聚糖溶液，继续超声处理20分钟，得到lm@cnc-pam-cs水凝胶悬浊液；所述液体金属为75%ga和25%in组成。

5、进一步地，所述多肽的氨基酸序列为：cppppksesksenfmqgtsyhhvy，其中锚定序列为cpppp，抗污染序列为kseskse，对il-1β的特异性识别序列为nfmqgtsyhhvy。

6、其有益效果在于：

7、聚丙烯酰胺（pam）是一种高亲水性聚合物，富含酰胺官能团，使其在抗污染界面构建中展现出良好的应用前景。其极性酰胺基团与周围水分子发生强相互作用，形成致密的界面水合层，有效抑制生物污染物的非特异性吸附，赋予材料优异的抗污染性能。此外，当进一步交联形成水凝胶后，仍能保持其固有的亲水性，并通过高度水合的网络结构增强水合层的稳定性。然而，这种致密的水合层和pam水凝胶的绝缘特性会阻碍电子转移，而紧密结合的水分子则增加了氧化还原探针向电极表面扩散的阻力，导致信号传导效率下降。因此，将pam水凝胶中引入导电组分，对于平衡抗污染性能与导电性至关重要。

8、液态金属（lm），尤其是镓基液态金属，因其优异的导电性、独特的流动性、良好的生物相容性和低毒性，在生物医学、微流控电子学和生物传感领域展现出巨大潜力。与传统固体导电填料相比，lm不仅能形成连续的导电通道，还可动态适应水凝胶内部结构变化，从而缓解界面处的内部应力，使其成为构建水凝胶的理想导电填料。然而，lm较高的表面张力导致其分散稳定性较差，容易发生自发聚集，进而影响其均匀分布及界面相互作用。为解决这一问题，本发明引入纤维素纳米晶（cnc）作为界面稳定剂。凭借其优异的生物相容性、高比表面积以及丰富的表面羟基和羧基，cnc能够通过配位作用稳定吸附于lm液滴表面，显著提高其分散性。同时，cnc还可与聚合物链之间形成氢键相互作用，从而促进水凝胶的结构稳定性。在超声作用下，cnc稳定的液态金属纳米液滴（lm@cnc）可以产生大量自由基和ga3+，这些物质可引发乙烯基单体的快速聚合形成水凝胶，无需额外添加传统引发剂或交联剂。因此，lm@cnc中的自由基和ga3+可触发丙烯酰胺单体的快速聚合，生成pam水凝胶。随后引入壳聚糖（cs），利用其与lm@cnc及pam链之间的氢键作用进一步增强网络稳定性，同时提供丰富的活性氨基位点以实现后续生物分子的固定。最终本发明制备出了一种兼具抗污染性能和导电性的多功能复合水凝胶（lm@cnc-pam-cs）。

9、然而值得注意的是，尽管lm@cnc的引入显著提升了水凝胶的导电性能，但在一定程度上可能会削弱抗污染界面的致密性。针对于此，本发明将不同抗污染材料进行整合，以构建具有协同作用的抗污染界面。多肽相较于其他抗污染材料相比，具有序列可编程性、结构多样性以及优异的生物相容性等明显优势。通过调控氨基酸的组成与排列，多肽能够同时赋予界面多种功能，包括抗污染性能、分子识别、抗菌活性以及界面锚定等多种能力。特别是两性离子多肽由等量的正负电荷氨基酸残基组成，可实现整体电荷中性，最大程度降低与生物污染物之间的非特异性静电相互作用。同时，其通过结合水分子形成稳定的水合层，有效抑制非特异性吸附。此外，将亲水性丝氨酸（ser）间隔插入两性离子（ke）序列中，在保留原有静电平衡和水合作用的基础上，利用其亲水侧链增强界面的水化能力，从而显著提升多肽的抗污染性能。

10、本发明还提供一种如上述基于水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：

11、（1）用al2o3粉末对玻璃碳电极进行抛光，然后采用去离子水和无水乙醇超声清洗，去除吸附的杂质；

12、（2）利用电化学沉积法在玻璃碳电极表面形成聚(3,4-乙烯二氧噻吩)薄膜；

13、（3）将lm@cnc-pam-cs水凝胶悬浊液滴涂在聚(3,4-乙烯二氧噻吩)薄膜表面孵育，制得lm@cnc-pam-cs水凝胶修饰电极，然后浸入pbs缓冲液中，使水凝胶充分溶胀至平衡状态，得到功能化水凝胶界面；

14、（4）将功能化水凝胶界面浸入磺基琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯溶液中反应，反应完成后用水充分洗涤以去除残留试剂；

15、（5）最后在洗涤后的界面表面滴加多肽溶液，并孵育，获得抗污染电化学传感器pep/lm@cnc-pam-cs/pedot/gce，即为所述水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器。

16、优选地，步骤（2）中所述电化学沉积法在玻璃碳电极表面形成聚(3,4-乙烯二氧噻吩)薄膜具体为：采用由0.01 mg聚(钠4-苯乙烯磺酸盐)和10 mm 3,4-乙二醇基噻吩组成的电化学聚合溶液，在1.0 v下通过安培法i-t模式沉积20秒，从而在玻璃碳电极表面形成聚(3,4-乙烯二氧噻吩)薄膜。

17、优选地，步骤（3）中所述lm@cnc-pam-cs水凝胶悬浊液用量为3.0 μl；所述孵育时间为2 h；所述pbs缓冲液的ph为7.4，浓度为10 mm。

18、优选地，步骤（4）中所述smcc溶液用量为10 μl，浓度为2.0 mm；反应时间为1 h。

19、优选地，步骤（5）中所述多肽溶液用量为10 μl，浓度为0.2 mg ml-1，孵育时间为2h。

20、本发明还提供上述基于水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器的应用。所述应用具体为：在复杂生物环境中的il-1β的检测；所述复杂生物环境优选为人体唾液。

21、本发明提供了一种基于水凝胶和多肽协同抗污染电化学传感器及制备方法与应用，与现有技术相比，其具有如下有效效果：

22、（1）本发明运用pam水凝胶含有丰富的酰胺基团，这些极性基团与周围水分子发生强相互作用，形成致密的界面水合层，有效抑制复杂生物样品中非特异性吸附，显著提高传感界面的抗污染能力。

23、（2）本发明通过构建兼具导电性与抗污染性的复合界面，在保证抗污染性能的同时维持优异的电子传输能力，提高目标物检测灵敏度。

24、（3）本发明设计的多功能多肽含锚定序列，使多肽锚定在水凝胶修饰界面的电极上，抗污染序列通过平衡相反电荷并形成稳定的水合层，通过水合作用和电荷呈中性，最大限度地减少非特异性蛋白质的吸附。识别序列通过提供互补的化学功能和空间构象，实现与il-1β特异性结合。

25、（4）本发明合成水凝胶方法简单，具有良好的生物相容性和低毒性，无额外添加引发剂和交联剂，所制备的传感器生物相容性好，可实现对复杂生物样本中目标物的检测，具有良好的临床检测和应用前景。