发酵石榴汁转化产尿石素的工艺优化的制作方法
本发明涉及发酵石榴汁领域，提供了一种通过优化发酵条件提高植物乳杆菌在石榴汁中的生长及尿石素转化的工艺方法。
背景技术：
1、尿石素类物质(uro)具有显著的抗氧化、抗炎、抗癌和抑菌作用，目前发现uro由肠道菌群生成，是存在于石榴和其他一些水果和坚果中的一类化合物鞣花单宁(ets)的一种天然代谢产物。利用生物发酵转化将石榴中的ets转化为uro来开发富含uro食品具有工艺简单、食用方便、安全等优势。中国发明专利zl202211404309.8中已经报道植物乳杆菌ccfm1291能够将膳食中的鞣花单宁代谢产生尿石素a，该植物乳杆菌及其发酵制品具有减缓衰老、延长寿命、提高动物运动能力等功能，具有显著的益生功效。但因该菌株在石榴汁中生长缓慢、活菌数低，并且发酵石榴汁过程中存在安石榴苷的降解及尿石素的转化效率不高的问题。
2、目前在发酵石榴汁领域，对植物乳杆菌单菌发酵及石榴汁中活性物质的转化研究较少，特别是对植物乳杆菌在石榴汁中的生长、安石榴苷的降解及尿石素的生成机制了解不足，这成为了石榴汁发酵及尿石素产业化生产中的技术瓶颈。因此迫切需要一种发酵石榴汁转化产尿石素的工艺优化方法。
技术实现思路
1、经研究发现，植物乳杆菌ccfm1291在石榴汁中生长缓慢的主要原因是氮源摄入不足。本发明通过向石榴汁中添加适量的氮源、调整ph值及稀释石榴汁浓度，解决了植物乳杆菌在石榴汁中生长缓慢、安石榴苷降解率低及尿石素生成效率不高的技术问题，使得植物乳杆菌在石榴汁中快速增殖，且能高效降解安石榴苷并生成尿石素。此外，本发明通过优化发酵条件，确定了最佳的氮源添加量、石榴汁稀释倍数及发酵时间，显著提高了尿石素的生成效率。
2、发酵制品的制备方法
3、因此，本发明的第一方面提供了一种植物乳杆菌发酵制品的制备方法，其包括以下步骤：
4、(1)制备发酵用培养液：将富含鞣花单宁的物质和发酵助剂搅拌均匀，进行高温杀菌；
5、(2)接种发酵：将植物乳杆菌接种至(1)中所述的发酵用培养液，进行发酵。
6、在一些实施方案中，所述富含鞣花单宁的物质选自以下中的一种或多种：水果(例如石榴、草莓、黑莓、覆盆子)、坚果(例如核桃、杏仁)和种子，及其衍生物。在一些实施方案中，所述富含鞣花单宁的物质为石榴汁。
7、在一些实施方案中，所述发酵助剂为酵母浸粉和/或蛋白胨。
8、在一些实施方案中，所述酵母浸粉选自以下中的一种或多种：酵母浸粉fm803、酵母浸粉fp103、和酵母浸粉fm985。在一些实施方案中，所述酵母浸粉选自以下中的一种或多种：酵母浸粉fm803和酵母浸粉fp103。在一些实施方案中，所述酵母浸粉为酵母浸粉fm803。
9、在一些实施方案中，所述蛋白胨为大豆蛋白胨或豌豆蛋白水解物。
10、在一些实施方案中，步骤(1)中所述富含鞣花单宁的物质为石榴汁；优选地，所述石榴汁为稀释后的石榴汁。
11、在一些实施方案中，所述石榴汁的稀释浓度为10％-100％，进一步优选地，稀释浓度为20％-80％，例如25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％；进一步优选地，稀释浓度为25％。
12、在一些实施方案中，步骤(1)中所述发酵助剂的含量为：0.001～1重量份；优选地，0.01～1重量份；优选地，0.5～1重量份；进一步优选地，0.5重量份。
13、在一些实施方案中，步骤(1)还包括调制所述发酵用培养液的初始ph值为6.5±1.0，优选6.5±0.5或6.5±0.2。
14、在一些实施方案中，步骤(1)中所述的发酵用培养液进一步包含缓冲盐；优选地，所述缓冲盐包含磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵。
15、在一些实施方案中，步骤(1)中所述的高温杀菌在以下条件下进行：80-150℃，优选90-100℃，例如，91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃条件下；
16、持续10-40min，优选15-30min，例如5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30min。
17、在一些实施方案中，步骤(2)中所述植物乳杆菌在接种前需要活化。在一些实施方案中，所述活化时间为8h～18h，例如8、9、10、11、12、13、14、15或16h；进一步优选地，所述活化时间为12h。
18、在一些实施方案中，步骤(2)中所述植物乳杆菌的接菌量为1％～12％；优选地，所述接菌量为1％～8％，例如1％、2％、3％、4％或5％；进一步优选地，所述接菌量为2％。
19、在一些实施方案中，步骤(2)中所述的发酵于0～42℃，优选30-37℃，优选35℃或37℃条件下进行；
20、发酵持续18h-72h，例如18、24、48、72h；优选24h。
21、在一些实施方案中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌ccfm1291(保藏编号为gdmccno：62802)。
22、发酵制品及其用途
23、第二方面，本发明还提供了一种根据第一方面所述的制备方法获得是发酵制品。
24、在一些实施方案中，所述发酵制品为发酵石榴汁。
25、在一些实施方案中，所述的发酵制品包含尿石素类物质、挥发性风味物质、维生素、氨基酸及其衍生物、生物活性肽或其他活性成分。
26、在一些实施方案中，所述尿石素类物质包括但不限于：尿石素m5、尿石素c或尿石素a。
27、在一些实施方案中，所述挥发性风味物质包括但不限于：2-庚醇(2-heptanol)、1-丁醇(1-butanol)、2-庚酮(2-heptanone)、2-甲基丙酸(2-methyl-propanoic acid)、丁酸、香叶醇和芳樟醇等。
28、在一些实施方案中，所述的发酵制品具有选自以下的任意一项性质：
29、(1)增加的尿石素含量；
30、(2)增加的植物乳杆菌活菌数量；
31、(3)增加的挥发性风味物质；
32、(4)降低的葡萄糖和果糖含量。
33、第三方面，本发明还提供给了第二方面所述的发酵制品在制备缓解动物自然衰老，和/或逆转认知衰退的产品中的用途。
34、第四方面，本发明还提供了第二方面所述的发酵制品用于缓解动物自然衰老，和/或逆转认知衰退。
35、发酵石榴汁的工艺优化方法
36、第五方面，本发明还提供了一种提高发酵石榴汁中尿石素转化率的工艺优化方法，其包括以下步骤：
37、(1)制备石榴发酵用培养液：将石榴汁和发酵助剂搅拌均匀，进行高温杀菌；
38、(2)接种发酵：将植物乳杆菌接种至(1)中所述的石榴发酵用培养液，进行发酵，得到发酵石榴汁。
39、在一些实施方案中，所述石榴汁为稀释的石榴汁。
40、在一些实施方案中，所述稀释的石榴汁的稀释浓度为10％-100％；优选地，所述稀释浓度为25％-80％，例如25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％；进一步优选地，所述稀释浓度为25％。
41、在一些实施方案中，所述发酵助剂为酵母浸粉和/或蛋白胨。
42、在一些实施方案中，步骤(1)中所述的酵母浸粉选自以下中的一种或多种：酵母浸粉fm803、酵母浸粉fp103、和酵母浸粉fm985；进一步优选地，所述酵母浸粉选自以下中的一种或多种：酵母浸粉fm803和酵母浸粉fp103；更优选地，所述酵母浸粉选自酵母浸粉fm803。
43、在一些实施方案中，所述发酵助剂的含量为：0.001～1重量份；优选地，0.01～1重量份；优选地，0.5～1重量份；进一步优选地，0.5重量份。
44、在一些实施方案中，步骤(1)还包括调制所述石榴发酵用培养液的初始ph值为6.5±1.0，优选6.5±0.5或6.5±0.2。
45、在一些实施方案中，步骤(1)中所述的石榴发酵用培养液进一步包含缓冲盐；优选地，所述缓冲盐包含磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵。
46、在一些实施方案中，步骤(1)所述的高温杀菌在以下条件下进行：80-150℃，优选90-100℃，例如，91、92、93、94、95、96、97、98、99或100℃条件下；
47、持续10-40min，优选21-30min，例如21、22、23、24、25、26、27、28、29或30min。
48、在一些实施方案中，步骤(2)中所述植物乳杆菌在接种前需要活化；优选地，所述活化时间为8h～18h，例如8、9、10、11、12、13、14、15或16h；进一步优选地，所述活化时间为12h。
49、在一些实施方案中，步骤(2)中所述植物乳杆菌的接菌量为1％～12％；优选地，所述接菌量为1％～8％，例如1％、2％、3％、4％或5％；进一步优选地，所述接菌量为2％。
50、在一些实施方案中，步骤(2)中所述的发酵于0～42℃，优选30-37℃，优选35℃或37℃条件下进行；
51、发酵持续18h-72h，例如18、24、48、72h；优选24h。
52、在一些实施方案中，所述的方法其具有选自以下任意一项改进的性质：
53、(1)提高尿石素的生产效率，例如提高安石榴苷的转化率、增加尿石素产量；
54、(2)增加发酵石榴汁中的植物乳杆菌活菌数量；
55、(3)增加发酵石榴汁中的挥发性风味物质；
56、(4)降低发酵石榴汁中的葡萄糖和果糖含量。
57、在一些实施方案中，所述尿石素包括但不限于：尿石素m5、尿石素c或尿石素a。
58、本发明所使用的术语“尿石素”是指尿石素类物质(urolithin,uro)。目前发现uro由肠道菌群生成，是存在于石榴和其他一些水果和坚果中的一类化合物鞣花单宁(ellagitannins,ets)的一种天然代谢产物。ets在胃和小肠被水解并转化形成鞣花酸(ellagic acid，ea)，然后在结肠经由定殖的肠道菌群代谢为尿石素m5(uro-m5)，由uro-m5代谢产生其他尿石素类物质，包括uro-c、uro-a(critical reviews in food science andnutrition,2022:1-23.)。
59、
60、在一些实施方案中，所述挥发性风味物质包括但不限于：2-庚醇、1-丁醇、2-庚酮、2-甲基丙酸、丁酸、香叶醇和芳樟醇。
61、发酵石榴汁及其用途
62、第六方面，本发明还提供了一种发酵石榴汁，其根据第五方面所述的方法获得。
63、在一些实施方案中，所述发酵石榴汁具有选自以下的任意一项性质：
64、(1)增加的尿石素含量；
65、(2)增加的植物乳杆菌活菌数量；
66、(3)增加的挥发性风味物质；
67、(4)降低的葡萄糖和果糖含量。
68、在一些实施方案中，所述尿石素包括：尿石素m5、尿石素c或尿石素a。
69、在一些实施方案中，所述挥发性风味物质包括但不限于：2-庚醇、1-丁醇、2-庚酮、2-甲基丙酸、丁酸、香叶醇和芳樟醇。
70、第七方面，本发明还提供了第六方面所述的发酵石榴汁，在制备缓解动物自然衰老，和/或逆转认知衰退的产品中的用途。
71、第八方面，本发明还提供了第六方面所述的发酵石榴汁用于缓解动物自然衰老，和/或逆转认知衰退。
72、发明的有益效果
73、本发明提供了一种通过优化发酵条件提高植物乳杆菌在石榴汁中的生长及尿石素转化的工艺方法，包括优化氮源种类、优化氮源添加量、优化添加石榴汁的稀释浓度、调整发酵用培养液的ph值、以及优化发酵时间。本发明的方法具有以下有益的技术效果：
74、(1)解决了植物乳杆菌在石榴汁中生长缓慢的技术问题，有效增加了植物乳杆菌活菌数量；
75、(2)提高了植物乳杆菌发酵石榴汁过程中安石榴苷降解率，从而增加了发酵石榴汁的尿石素含量；
76、(3)有效降低了植物乳杆菌发酵石榴汁过程中的葡萄糖和果糖含量；
77、(4)增加了发酵石榴汁中的挥发性风味物质，对石榴汁的风味有显著贡献。
