硫辛酸蛋白连接酶A在制备抗重金属离子抑制的过氧化氢分解制剂中的应用

本发明涉及生物，具体涉及硫辛酸蛋白连接酶a在制备抗重金属离子抑制的过氧化氢分解制剂中的应用。

背景技术：

1、过氧化氢(h2o2)是生物代谢和工业生产中的常见副产物，高浓度h2o2会导致氧化应激、细胞损伤及环境污染。传统化学法(如fenton反应)降解h2o2需强酸条件，并产生二次污染。相比之下，生物酶法(如过氧化氢酶)因其高效、专一和环境友好特性成为研究热点。然而，现有过氧化氢酶在实际应用中仍存在诸多问题，限制其广泛应用。

2、常规过氧化氢酶具有辅因子依赖性，如哺乳动物catalase或微生物katg，均依赖血红素(heme)或金属离子(fe2+/mn2+)作为辅因子以维持催化活性。缺乏血红素时，catalase会完全失活，而重组表达含血红素的酶制剂需复杂的后修饰工艺，大幅增加生产成本。与此同时，常规过氧化氢酶对金属离子敏感。工业废水或生理环境中的金属离子(、co2+、mn2+)会抑制酶活性。据文献报道，(吴甜甜；李晓亚；王洪玲；等.索诺拉沙漠芽孢杆菌s262过氧化氢酶的异源表达及酶学性质[j].微生物学通报；2024年03期)，异源表达的芽孢杆菌过氧化氢酶在0.1mm k+存在时活性下降39％，而fe2+虽可短暂提升活性，但超过1mm即引发不可逆沉淀。

3、随着生物催化技术的发展，过氧化氢的绿色降解成为研究热点。在环境治理领域，处理含重金属废水时需耐受fe3+/co2+的酶制剂，而传统酶制剂易被金属离子抑制。在医疗美容领域，亦需要无毒、稳定的酶制剂以降解过氧化氢，进而降低伤口炎症或细胞损伤。基于上述问题，目前尚未见报道天然来源、无需辅因子且耐受金属离子干扰的具有降解过氧化氢能力的酶。

技术实现思路

1、基于现有技术中的不足，本发明提供了一类新发现的具有降解过氧化氢能力的天然酶。与常规过氧化氢酶不同，该类酶催化过程无需辅因子，具有抗重金属离子抑制特性。本发明还涉及该酶的基因序列、突变体、同源蛋白、制备方法及其在医疗美容、工业催化、环境治理等领域的应用。该类酶具有抗重金属离子抑制、无需辅因子等特性，制备工艺简单，对环境友好。

2、本发明的具体技术方案如下：

3、具有降解过氧化氢能力的天然酶在制备抗重金属离子抑制的过氧化氢分解制剂中的应用。

4、所述天然酶为硫辛酸蛋白连接酶，该酶不需要任何辅因子即可降解过氧化氢。

5、所述天然酶可来源于大肠杆菌(escherichia coli)，即硫辛酸蛋白连接酶a(eclpla)，所述天然酶还可以是seq id no.1所示硫辛酸蛋白连接酶(eclpla)的同源蛋白，所述同源蛋白(同源性≥70％，优选的，同源性≥90％)同样具有降解过氧化氢活性，如柯式柠檬酸杆菌(citrobacter koseri)同源基因表达产物(cklpla)。

6、具体的，所述硫辛酸蛋白连接酶a氨基酸序列为如seq id no.1所示，或与其具有≥70％同源性且保留抗重金属离子抑制分解过氧化氢特性的同源蛋白或变体。

7、进一步地，所述硫辛酸蛋白连接酶a是在seq id no.1基础上发生以下突变位点中至少一个的蛋白：s72、g75、f78、n121、d122、k133、r140、h149或t151、v180和s182。

8、更进一步地，所述硫辛酸蛋白连接酶a是在seq id no.1基础上发生以下突变中至少一个的蛋白：s72a、g75a、f78a、n121a、d122a、k133a、r140a、h149a或t151a、v180a和s182a。

9、更有优选的，所述硫辛酸蛋白连接酶a是在seq id no.1基础上发生以下突变中至少一个的蛋白：s72a、f78a、n121a、k133a、v180a和s182a。

10、以上变体相对于lpla野生型(wt)，在过氧化氢降解能力上均有更好的降解效果。

11、优选的，所述硫辛酸蛋白连接酶a的编码基因序列如seq id no.2所示；

12、或者，所述硫辛酸蛋白连接酶a为与seq id no.2所示序列具有70％以上，或具有80％以上，或者是具有90％以上同源性的基因编码的硫辛酸蛋白连接酶a；

13、或者，所述硫辛酸蛋白连接酶a是在seq id no.2所示序列的两端增加了一定长度的核苷酸编码的蛋白，增加的核苷酸是6个组氨酸序列、谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白序列、或麦芽糖结合蛋白标签序列。

14、优选的，所述重金属离子为锰离子、钴离子和铁离子中的至少一种，所述重金属离子的浓度为1-20mm。

15、在本发明具体实施例中，硫辛酸蛋白连接酶a在分别含5mm fe3+、mn2+、co2+等金属离子的模拟废水中，h2o2降解率＞90％，显著高于过氧化氢酶组(≤50％)。

16、本发明还提供了一种在重金属废水中降解过氧化氢的方法，使用硫辛酸蛋白连接酶a作为催化剂，无需添加辅因子，在重金属废水环境下实现过氧化氢的分解。

17、具体的，所述重金属废水中重金属离子浓度为1-20mm，所述重金属为锰、钴和铁中的至少一种。

18、本发明还提供了一种抗重金属离子抑制的过氧化氢分解组合物，包含硫辛酸蛋白连接酶a或其变体和缓冲体系，所述缓冲体系在浓度为20-100mm、反应温度为0-50℃，ph 6-8范围内维持酶活性。所述组合物为酶的商业化产品，如试剂盒、工业催化剂等。

19、所述硫辛酸蛋白连接酶a(eclpla)降解过氧化氢的功能发生在一定缓冲溶液体系中，无需金属离子或辅因子的参与，即使有高浓度金属离子存在也不会对其活性产生明显抑制。

20、具体的，通过基因工程手段将seq id no.1所示的硫辛酸蛋白连接酶a的基因序列插入载体并添加his标签，转化至宿主细胞中表达，经高压匀浆破碎、镍柱纯化后，获得纯度≥80％的蛋白；

21、进一步的，所述宿主为大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫表达系统；

22、进一步的，表达载体包括并不限于质粒pet28a、pet22b、pet21a、pet30a等；

23、进一步的，所述缓冲溶液包括但不限于tris-hcl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲液中的一种，浓度为20-100mm、ph范围为6-8，反应温度为0-40℃。

24、本发明针对传统过氧化氢酶存在的辅因子依赖性、金属离子敏感性等核心缺陷，提供了一种抗金属离子抑制并降解过氧化氢的天然酶及其衍生技术方案。该类酶无需任何辅因子即可高效催化过氧化氢分解，且在重金属离子干扰环境下仍保持优异活性。

1.硫辛酸蛋白连接酶a在制备抗重金属离子抑制的过氧化氢分解制剂中的应用。

2.硫辛酸蛋白连接酶a在含重金属的环境的治理、工业催化领域中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述硫辛酸蛋白连接酶a来源于大肠杆菌(escherichia coli)或柯式柠檬酸杆菌(citrobacter koseri)。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述硫辛酸蛋白连接酶a氨基酸序列为如seq id no.1所示，或与其具有≥70％同源性且保留抗重金属离子抑制分解过氧化氢特性的同源蛋白或变体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述硫辛酸蛋白连接酶a是在seq id no.1基础上发生以下突变位点中至少一个的蛋白：s72、g75、f78、n121、d122、k133、r140、h149或t151、v180和s182。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述硫辛酸蛋白连接酶a是在seq id no.1基础上发生以下突变中至少一个的蛋白：s72a、g75a、f78a、n121a、d122a、k133a、r140a、h149a或t151a、v180a和s1 82a。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述硫辛酸蛋白连接酶a的编码基因序列如seq id no.2所示；

8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述重金属离子为锰离子、钴离子和铁离子中的至少一种，所述重金属离子的浓度为1-20mm。

9.一种在重金属废水中降解过氧化氢的方法，其特征在于，使用硫辛酸蛋白连接酶a作为催化剂，无需添加辅因子，在重金属废水环境下实现过氧化氢的分解。

10.根据权利要求9所述含重金属废水中降解过氧化氢的方法，其特征在于，所述重金属废水中重金属离子浓度为1-20mm，所述重金属为锰、钴和铁中的至少一种。

11.一种抗重金属离子抑制的过氧化氢分解组合物，其特征在于，包含硫辛酸蛋白连接酶a或其同源蛋白、变体和缓冲体系，所述缓冲体系在浓度20-100mm，ph6-8，反应温度0-50℃范围内维持酶活性。

12.权利要求11所述的抗重金属离子抑制的过氧化氢分解组合物在含重金属的环境的治理、工业催化领域的应用。