一种过渡6-苄氨基嘌呤增殖和生根协同调控的草莓原原种组培生根苗的繁育方法、筛选方法和应用与流程
本发明涉及组织培养，特别是涉及一种过渡6-苄氨基嘌呤增殖和生根协同调控的草莓原原种组培生根苗的繁育方法、筛选方法和应用。
背景技术：
1、在草莓组培快繁体系中，植物生长调节剂的使用是影响增殖效率和生根质量的关键因素。植物生长调节剂（pgrs）虽然是植物组织培养中不可或缺的关键因素，但其不当施用同样会给组培过程带来多方面的负面影响，如6-ba是草莓离体增殖中常用的细胞分裂素，能够促进腋芽萌发和芽丛形成；但在含较高浓度6-ba的培养基中连续继代时，易导致芽苗矮化、过度丛生、愈伤组织或玻璃化增加，并对后续生根、出瓶炼苗及移栽质量产生不利影响。因此，增殖培养阶段的6-ba处理不仅关系当代增殖效果，其对后续根系发生和发育的后效也应一并考虑。
2、而在草莓原原种生产过程中，种苗质量要求更为严苛，不仅要求较高的繁殖系数，同时还需保障组培苗健壮程度、根系发育质量与移栽成活率，但是目前的育苗效果不理想，相关方案未同时以过渡阶段的有效增殖和后续无植物生长调节剂条件下的生根表现作为过渡浓度的确定依据，因而未能明确兼顾扩繁效率与后续生根速度和质量。植物生长调节剂种类丰富，不同种类、不同浓度的植物生长调节剂复配后所产生的调控效应存在差异，即便为同一种植物生长调节剂，施用浓度不同也会呈现出不同的调控效果，且不同培养基中的植物生长调节剂之间存在交互影响。因此，如何通过调节植物生长调节剂的种类和浓度梯度实现增殖与生根的协同调控，在保障增殖效率的同时优化生根质量，是当前草莓组培快繁领域亟待解决的关键技术问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种过渡6-苄氨基嘌呤增殖和生根协同调控的草莓原原种组培生根苗的繁育方法、筛选方法和应用，以解决上述现有技术存在的无法兼顾扩繁效率与随后无植物生长调节剂生根的速度和质量问题。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供了一种过渡6-苄氨基嘌呤增殖和生根协同调控的草莓原原种组培生根苗的繁育方法，包括以下步骤：
4、s1，将草莓无菌芽苗接种于含0.5 mg/l 6-ba的增殖培养基中，连续继代培养至少3代，得到经0.5 mg/l 6-ba多代培养的母苗；
5、s2从所述母苗中分切出单芽，转接于含0.2 mg/l 6-ba的过渡增殖培养基中进行末代过渡增殖培养，得到过渡芽苗；
6、s3，从所述过渡芽苗中分切出单芽，转接于不含任何植物生长调节剂的生根培养基中进行生根培养，得到完成离体生根、用于后续出瓶炼苗的草莓原原种组培生根苗。
7、本发明转接接种时将各合格单芽置于相互分离的接种位点，将单芽基部竖直插入生根培养基，并保持接种深度一致。步骤s3培养期间不更换培养基，且不补加任何植物生长调节剂。
8、本发明还可以将步骤s1所得母苗分为继续扩繁组和计划生根组；所述继续扩繁组继续在步骤s1所述含0.5 mg/l 6-ba且不含生长素的常规增殖培养基中培养，所述计划生根组依次进行步骤s2的单周期末代过渡增殖培养和步骤s3的无植物生长调节剂生根培养。
9、本发明的草莓原原种组培生根苗的繁育方法采用6-ba浓度逐步递减的调控策略，形成6-ba 0.5mg/l→0.2mg/l→0mg/l的明确生产顺序，并可将组培材料分为继续扩繁组和计划生根组：继续扩繁组维持0.5 mg/l 6-ba培养，计划生根组仅在生根前接受一个0.2mg/l 6-ba过渡周期，因而无需使全部材料长期处于低6-ba条件，便于连续化繁育管理。
10、本发明中，“末代过渡增殖培养”是指仅在芽苗进入无植物生长调节剂生根前实施一个继代周期的6-ba处理。0.2 mg/l 6-ba用于计划生根材料的末代过渡，不替代0.5 mg/l6-ba用于继续扩大增殖规模的培养周期。
11、可选的是，所述增殖培养基由ms基础培养基、0.5 mg/l 6-ba、30 g/l蔗糖和6 g/l琼脂组成，培养基ph为5.8-6.0；
12、所述过渡增殖培养基由ms基础培养基、0.2 mg/l 6-ba、30 g/l蔗糖和6 g/l琼脂组成，培养基ph为5.8-6.0；
13、所述生根培养基由1/2 ms基础培养基、20 g/l蔗糖和6 g/l琼脂组成，培养基ph为5.8-6.0。本发明各步骤所用培养基按相同体积分装于规格为300 ml的培养瓶中，经121℃高压蒸汽灭菌30 min后冷却凝固。
14、本发明的生根培养基不添加6-ba、naa、iba等植物生长调节剂，为“无激素生根”，可简化培养基组成和配制操作，减少植物生长调节剂用量，并降低外源植物生长调节剂对根系发生及苗体后续生长的持续干扰。本发明中的“无激素生根”是指生根培养基不添加任何植物生长调节剂，并不表示整个繁育过程完全不使用植物生长调节剂；6-ba仅用于增殖培养和末代过渡增殖阶段。
15、可选的是，每个继代培养的时间为29-31 d，更优选为30 d；所述过渡增殖培养的时间为1个继代周期；所述1个继代周期的时间为29-31 d，更优选为30 d；所述生根培养的时间为19-21 d，更优选为20 d。
16、可选的是，所述单芽为合格单芽，所述合格单芽具有独立生长点的完整单芽，分切后得到的单芽的株高不低于1.5 cm，具有至少1片展开叶，无污染、无玻璃化、无褐化和无坏死，且基部无愈伤组织。
17、可选的是，所述草莓的品种为香野。
18、可选的是，所述继代培养的温度为25±1℃，光周期为14-16 h/d，更优选为16 h/d，光照强度为50±5μmol•m-2•s-1。
19、可选的是，所述过渡增殖培养的温度为25±1℃，光周期为14-16 h/d，更优选为16h/d，光照强度为50±5μmol•m-2•s-1；
20、所述生根培养的温度为25±1℃，光周期为14-16h/d，更优选为16 h/d，光照强度为50±5μmol•m-2•s-1。
21、本发明提供了草莓原原种组培生根苗的繁育方法在如下至少一种中的应用：
22、1）提高根系数量、根系长度和根系鲜重中的至少一种；
23、2）缩短根系发生时间。
24、本发明提供了一种草莓组培中末代过渡6-ba浓度的筛选方法，包括以下步骤：
25、（1）将草莓无菌芽苗接种于增殖培养基中，连续继代培养至少3代，得到多代培养的母苗；所述增殖培养基由ms基础培养基、0.5 mg/l 6-ba、30 g/l蔗糖和6 g/l琼脂组成；可选的是，所述继代培养的温度为25±1℃，光周期为14-16 h/d，更优选为16 h/d，光照强度为50±5μmol•m-2•s-1；
26、（2）从所述母苗中分切出单芽，分别接种于过渡增殖培养基中进行过渡增殖培养，得到过渡芽苗；所述过渡增殖培养基由ms基础培养基、0.1-0.4 mg/l 6-ba、30 g/l蔗糖和6g/l琼脂组成；可选的是，所述过渡增殖培养的温度为25±1℃，光周期为14-16 h/d，更优选为16 h/d，光照强度为50±5μmol•m-2•s-1；
27、（3）所述过渡增殖培养30d后，测定各个处理的所述过渡芽苗的有效增殖系数，将所述有效增殖系数低于3的处理组判定为增殖不足并筛除；可选的是，所述过渡增殖培养的温度为25±1℃，光周期为14-16 h/d，更优选为16 h/d，光照强度为50±5μmol•m-2•s-1；
28、（4）从其余处理得到的所述过渡芽苗中选取合格单芽，分别转接至生根培养基中进行生根培养，记录根系发生时间，并在预设培养终点测定根系数量、根系长度和根系鲜重；
29、（5）在所述预设培养终点，利用差异显著性分析方法，将根系发生时间最早、根系数量最多且根系鲜重最高的处理确定为所述末代过渡6-ba浓度。在本发明的具体实施例中，所述根系发生时间为6.17d；培养至20 d时，根系数量（根系发生数量）为13.17条/丛；培养至20 d时，根系平均鲜重为0.041 g/株。
30、本发明将草莓无菌芽苗进行连续继代培养至少3代后，得到同批次母苗，选取初始规格一致的母苗进行分切，分切所得的单芽进行末代过渡增殖培养，培养一个继代周期，得到过渡芽苗，对全部的有效增殖系数进行比较，筛除有效增殖系数低的处理组，选取初始规格一致的过渡芽苗进行分切，分切得到的合格单芽进行生根培养，对根系发生时间、根系长度和根系鲜重分别进行单因素方差分析，并采用tukey法进行多重比较，以
p＜0.05作为差异显著的判定标准；将根系发生时间最早、根系数量最多且根系鲜重最高的处理确定为末代过渡6-ba浓度。
31、本发明公开了以下技术效果：
32、本发明提供了一种过渡6-苄氨基嘌呤增殖和生根协同调控的草莓原原种组培生根苗的繁育方法，在0.5 mg/l 6-ba常规增殖与无植物生长调节剂生根之间设置一个0.2mg/l 6-ba末代过渡周期。该处理既可保持有效的增殖水平，又可缩短后续根系发生时间，增加根系数量、根系长度和根系鲜重，从而兼顾扩繁效率、生根速度和根系生物量。
