一种延长柑橘木虱RNA农药持效期的壳聚糖复合纳米制剂

本发明属于生物农药与纳米递送制剂，具体涉及靶向防控柑橘木虱、长效缓释 dsrna 的壳聚糖复合纳米制剂，适用于柑橘园柑橘木虱防控、柑橘黄龙病媒介昆虫综合治理，属于 rna 干扰生物农药载体改性加工技术范畴。

背景技术：

1、柑橘木虱是柑橘黄龙病唯一自然传播媒介，灭杀柑橘木虱是阻断黄龙病蔓延的核心手段。rna 干扰（dsrna）农药凭借靶向特异性、环境安全、无残留、不易产生抗药性优势成为绿色防控热点，但裸 dsrna 田间应用短板突出：

2、自然环境中易被紫外光照、田间核酸酶快速降解，叶面喷施后 2～3d 即失活，常规制剂持效期仅 3～5 天，需要频繁多次施药，用工成本高；

3、柑橘木虱为刺吸式口器，裸露 dsrna 难以穿透虫体表皮与中肠屏障，被昆虫中肠rnase 水解，害虫摄取效率低，防效不稳定；

4、常规单一壳聚糖纳米颗粒耐雨水冲刷性能差，雨水淋溶后载体崩解、dsrna 外泄流失，无法实现长效控释。

5、现有改性壳聚糖载体多采用单一交联改性，仅小幅提升稳定性，无法兼顾抗紫外降解、耐雨水冲刷、虫体肠道 ph 响应释放三重性能，柑橘产区高温多雨环境下 rna 农药长效化难题难以解决。因此开发可大幅延长 dsrna 农药持效期、耐环境胁迫、肠道靶向释药的复合纳米制剂具备迫切产业需求。 技术实现要素：

6、（一）解决的技术问题  克服现有裸 dsrna 易降解、常规壳聚糖纳米制剂耐候性差、持效期短、雨水易淋失、虫体利用率低的缺陷，提供一种壳聚糖复合纳米载体包覆靶向柑橘木虱关键基因 dsrna 的复合纳米制剂，实现抗紫外、抗核酸酶降解、耐雨水冲刷、木虱中肠 ph 智能缓释，显著延长田间农药持效期。（二）技术方案

7、方案 1：一种延长柑橘木虱 rna 农药持效期的壳聚糖复合纳米制剂

8、如图 1 所示，本发明制剂采用 "内核 - 内层 - 中间层 - 外层" 四层核壳结构设计，由内核活性组分与复合纳米载体外壳组成；

9、内核活性物 (1)：靶向柑橘木虱几丁质合成酶基因（chs1）/ 乙酰胆碱酯酶基因（ache）的 dsrna；dsrna 核苷酸序列选自 seq id no.1、seq id no.2 任一，dsrna 分子量400～800 bp；

10、复合纳米载体原料（质量配比）：改性壳聚糖 1.8～3.2 份、羧甲基淀粉 0.4～0.8份、三聚磷酸钠 0.15～0.3 份、聚乙二醇 2000（peg2000）0.2～0.5 份、海藻酸钠 0.2～0.6 份；

11、载体经离子交联 + 表面亲水改性形成核壳结构纳米微球，dsrna 被完全包封于纳米颗粒内部空腔；其中内层交联网络 (2) 由改性壳聚糖与三聚磷酸钠通过离子键交联形成，负责包封 dsrna 并提供 ph 响应释放性能；中间增强层 (3) 由羧甲基淀粉与海藻酸钠复合形成，负责增强载体机械强度与叶片粘附力；外层亲水改性层 (4) 由 peg2000接枝修饰形成，负责提升载体抗紫外降解能力与分散稳定性；制剂整体呈球形 (5)，平均粒径 180～320 nm，zeta 电位 + 22～+35 mv。

12、优选配比：改性壳聚糖 2.5 份、羧甲基淀粉 0.6 份、三聚磷酸钠 0.22 份、peg2000 0.35 份、海藻酸钠 0.4 份。

13、所述改性壳聚糖为低聚壳聚糖经柠檬酸轻度接枝改性产物，低聚壳聚糖脱乙酰度≥92%，分子量 3000～12000 da，接枝度 15%～25%，提升载体紫外屏蔽性能与 ph 响应能力。

14、方案 2：上述壳聚糖复合纳米制剂的制备方法

15、如图 7 所示，本发明制备方法包含如下步骤：

16、s1、改性壳聚糖水溶液配制：冰醋酸 - 醋酸钠缓冲液（ph=5.0～5.6）溶解改性壳聚糖，配制成质量分数 0.25%～0.4% 壳聚糖母液；依次加入羧甲基淀粉、peg2000，常温低速搅拌 30～50 min，得到 a 液；

17、s2、交联助剂配制：三聚磷酸钠 + 海藻酸钠溶于无菌纯水，配制成质量分数0.12% 交联 b 液；

18、s3、dsrna 稀释：无菌 depc 水溶解靶向 dsrna，配制浓度 1.2～1.8 μg/μldsrna 溶液，4℃保存备用；

19、s4、纳米颗粒自组装：将 a 液置于磁力搅拌器上，转速控制在 600～800 rpm，用注射器以 0.5～1.0 ml/min 的速度缓慢滴加 b 液，滴加完成后继续搅拌 15 min；然后以相同速度滴加 dsrna 溶液，滴加完成后继续搅拌 30 min，得到纳米颗粒混悬液；

20、s5、固化与纯化：将混悬液置于 4℃冰箱中固化 2～4 h，然后用超纯水透析 24 h（截留分子量 8000～14000 da），每 6 h 更换一次透析液，去除未包封的 dsrna 和游离交联剂；

21、s6、冻干成型：向透析后的混悬液中加入质量分数 5%～8% 的甘露醇作为冻干保护剂，预冻 - 40℃ 4 h，然后真空冷冻干燥 24 h，得到白色粉末状壳聚糖复合纳米制剂。

22、方案 3：上述壳聚糖复合纳米制剂在柑橘木虱防控中的应用

23、将壳聚糖复合纳米制剂用清水稀释至 dsrna 终浓度为 50～200 μg/ml，采用叶面喷雾方式施用于柑橘植株，每 15～20 天喷施一次。（三）有益效果

24、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

25、显著延长持效期：复合载体形成的致密四层核壳结构可有效屏蔽紫外光和核酸酶对 dsrna 的降解，田间持效期从常规制剂的 3～5 天延长至 15～20 天，减少施药次数 3～4 次 / 年，大幅降低用工成本。

26、优异的耐雨水冲刷性能：羧甲基淀粉和海藻酸钠的协同作用增强了纳米颗粒在柑橘叶片表面的粘附力，经模拟雨水冲刷（降雨量 10 mm/h，冲刷 30 min）后，叶片表面dsrna 保留率仍达 75% 以上，远高于单一壳聚糖纳米颗粒的 32%。

27、木虱中肠 ph 智能响应释放：改性壳聚糖在酸性环境（木虱中肠 ph=5.0～6.0）下快速溶胀崩解，释放内部包封的 dsrna，而在中性环境（叶片表面 ph=6.5～7.5）下稳定存在，实现靶向释药，提高 dsrna 利用率。

28、高包封率和载药量：本发明制备的纳米制剂 dsrna 包封率达 85%～92%，载药量达 12%～18%，显著高于现有技术水平。

29、环境友好：所有载体原料均为天然可降解高分子材料，对非靶标生物安全，无残留，符合绿色农业发展要求。

技术实现思路

1.一种延长柑橘木虱 rna 农药持效期的壳聚糖复合纳米制剂，其特征在于，采用 "内核 - 内层 - 中间层 - 外层" 四层核壳结构，由内核活性组分与复合纳米载体外壳组成；

2.根据权利要求 1 所述的壳聚糖复合纳米制剂，其特征在于，所述 dsrna 核苷酸序列选自 seq id no.1、seq id no.2 任一，dsrna 分子量 400～800 bp。

3.根据权利要求 1 所述的壳聚糖复合纳米制剂，其特征在于，所述复合纳米载体原料的优选质量配比为：改性壳聚糖 2.5 份、羧甲基淀粉 0.6 份、三聚磷酸钠 0.22 份、聚乙二醇 2000 0.35 份、海藻酸钠 0.4 份。

4.根据权利要求 1 所述的壳聚糖复合纳米制剂，其特征在于，所述改性壳聚糖为低聚壳聚糖经柠檬酸轻度接枝改性产物，低聚壳聚糖脱乙酰度≥92%，分子量 3000～12000 da，接枝度 15%～25%。

5.一种如权利要求 1-4 任一项所述壳聚糖复合纳米制剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

6.一种如权利要求 1-4 任一项所述壳聚糖复合纳米制剂在柑橘木虱防控中的应用，其特征在于，将壳聚糖复合纳米制剂用清水稀释至 dsrna 终浓度为 50～200 μg/ml，采用叶面喷雾方式施用于柑橘植株，每 15～20 天喷施一次。