一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基及制备与培养方法

本发明涉及药用植物组织培养，具体为一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基及制备与培养方法。

背景技术：

1、植物组织培养是实现黄精种苗规模化快繁的有效技术手段。目前，国内已公开的黄精组培相关研究及培养基配方，其研究对象主要集中于多花黄精、滇黄精等南方品种。在培养基配制方面，ms培养基为最常用的基础培养基，碳源多采用蔗糖，凝固剂多选用琼脂；植物生长调节剂通常选用6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，但具体用量因品种和培养阶段而异，尚无统一标准。在抑褐措施方面，已有部分研究尝试在培养基中添加单一抗氧化物质以降低外植体褐化率。此外，现有技术中组织培养的常规操作流程一般包括培养基配制、ph调节、高温灭菌、冷却凝固、外植体消毒接种及恒温恒光培养等基本步骤。

2、然而，现有技术仍存在以下不足：北方鸡头黄精根茎芽中多酚含量较高，常规ms培养基及南方品种配方直接套用时，单一抗氧化体系难以有效抑制外植体褐化，导致接种材料大量坏死。现有激素配比多为固定浓度组合，缺乏针对北方鸡头黄精根茎芽分化的精准协同调控，易产生愈伤组织多、不定芽分化少及芽体畸形等问题。传统琼脂凝固剂在培养过程中易发生液化，增加污染风险。此外，培养基高温灭菌后冷却阶段瓶内壁产生的冷凝水常被忽视，致使外植体长期浸泡而腐烂。上述缺陷相互叠加，导致不定芽诱导周期长、出芽数量少、成功率低，严重制约了北方鸡头黄精组培快繁技术的产业化应用。

3、现有技术缺少北方鸡头黄精根茎芽专用初代诱导培养基，单一抗氧化抑褐不足，激素配比不适，凝固剂易液化，冷凝水致外植体腐烂，诱导周期长、出芽少。

技术实现思路

1、（一） 解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基及制备与培养方法，以ms培养基为基础，添加6-ba0.5～3.5mg/l、naa0.1～2.0mg/l、pvp100～1500mg/l、vc20～150mg/l、蔗糖30g/l、卡拉胶7g/l，ph5.8；经溶解、加激素、调ph、灭菌后，于95℃顺时针摇晃消除冷凝水，冷却备用；将消毒后的根茎芽外植体接种于该培养基上，于24±2℃、2000lx、12h光暗交替条件下培养，诱导不定芽。

3、（二）技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基及制备与培养方法，包括以ms培养基为基础，每升培养基含有：6-苄氨基腺嘌呤0.5～3.5mg、萘乙酸0.1～2.0mg、聚乙烯吡咯烷酮100～1500mg、l-抗坏血酸20～150mg、蔗糖30g、卡拉胶7g，用蒸馏水定容至1l；培养基的ph为5.8。

5、优选的，每升培养基中6-苄氨基腺嘌呤为2.5mg，萘乙酸为0.8mg，聚乙烯吡咯烷酮为800mg，l-抗坏血酸为80mg。

6、优选的，所述培养基用于北方鸡头黄精根茎芽外植体的初代诱导培养。

7、优选的，包括以下步骤：

8、s1：将ms干粉、蔗糖和卡拉胶溶于蒸馏水中，定容至1l；

9、s2：加入6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、聚乙烯吡咯烷酮和l-抗坏血酸，混匀；

10、s3：调节ph至5.8；

11、s4：分装后于121℃灭菌20min；

12、s5：灭菌后降温至95℃，取出培养瓶，顺时针摇晃一周，使培养基涂布瓶内壁，然后平放冷却凝固。

13、优选的，步骤s5中摇晃时间为3～5秒。

14、优选的，将消毒后的根茎芽外植体接种于权利要求1～3任一项所述培养基上，于24±2℃、光照强度2000lx、光周期12h光照/12h黑暗条件下培养。

15、优选的，所述消毒包括75%酒精处理30秒和0.1%次氯酸钠处理8分钟。

16、优选的，培养时间为10～28天。

17、优选的，6-苄氨基腺嘌呤为2.0～3.0mg/l，萘乙酸为0.5～1.5mg/l，聚乙烯吡咯烷酮为500～1200mg/l，l-抗坏血酸为50～120mg/l。

18、优选的，步骤s5中摇晃操作在培养基熔融状态下进行。

19、与现有技术相比，本发明提供了一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基及制备与培养方法，具备以下有益效果：

20、1.本发明在培养基中同时添加聚乙烯吡咯烷酮和l-抗坏血酸，二者协同吸附多酚并清除氧化自由基，有效抑制外植体褐化。

21、2.本发明通过限定6-苄氨基腺嘌呤与萘乙酸的协同配比，精准调控细胞分裂与伸长平衡，显著提高不定芽诱导率和出芽数量。

22、3.本发明采用卡拉胶替代琼脂作为凝固剂，培养基凝固稳定性强，灭菌后不易液化，降低污染风险。

23、4.本发明在灭菌后降温至95℃时顺时针摇晃培养瓶，使熔融培养基涂布瓶内壁吸附冷凝水，有效消除瓶内积水，避免外植体腐烂。

24、5.本发明提供从培养基制备到不定芽诱导的完整配套工艺，操作标准化，适用于工厂化批量育苗。

1.一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基，其特征在于，以ms培养基为基础，每升培养基含有：6-苄氨基腺嘌呤0.5～3.5mg、萘乙酸0.1～2.0mg、聚乙烯吡咯烷酮100～1500mg、l-抗坏血酸20～150mg、蔗糖30g、卡拉胶7g，用蒸馏水定容至1l；培养基的ph为5.8。

2.根据权利要求1所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基，其特征在于：每升培养基中6-苄氨基腺嘌呤为2.5mg，萘乙酸为0.8mg，聚乙烯吡咯烷酮为800mg，l-抗坏血酸为80mg。

3.根据权利要求2所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基，其特征在于：所述培养基用于北方鸡头黄精根茎芽外植体的初代诱导培养。

4.一种权利要求1～3任一项所述培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基培养方法，其特征在于：步骤s5中摇晃时间为3～5秒。

6.一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基培养方法，其特征在于：将消毒后的根茎芽外植体接种于权利要求1～3任一项所述培养基上，于24±2℃、光照强度2000lx、光周期12h光照/12h黑暗条件下培养。

7.根据权利要求6所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基培养方法，其特征在于：所述消毒包括75%酒精处理30秒和0.1%次氯酸钠处理8分钟。

8.根据权利要求6或7所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基培养方法，其特征在于：培养时间为10～28天。

9.根据权利要求1～3任一项所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基培养方法，其特征在于：6-苄氨基腺嘌呤为2.0～3.0mg/l，萘乙酸为0.5～1.5mg/l，聚乙烯吡咯烷酮为500～1200mg/l，l-抗坏血酸为50～120mg/l。

10.根据权利要求4或5所述的一种北方鸡头黄精根茎芽诱导培养基培养方法，其特征在于：步骤s5中摇晃操作在培养基熔融状态下进行。