帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型的构建方法及其应用

本技术属于动物模型构建，具体涉及帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、帕金森病（parkinson's disease, pd）是一种常见于中老年的神经退行性疾病，其核心病理特征为黑质多巴胺能神经元进行性丢失和路易小体形成。为研究其发病机制和筛选药物，动物模型是不可或缺的工具。目前，构建pd动物模型的主流技术方案包括神经毒素诱导模型（如向动物体内注射mptp、6-ohda、鱼藤酮等药物构建的动物模型）、基因工程模型（如在动物基因组中引入人源a53t突变α-syn基因或其他基因）以及病症结合模型（如在疾病模型基础上，通过饥饿、疲劳等中医病因学方法叠加“证”的因素）。

2、然而，现有的这些方法构建的动物模型虽然为pd的研究提供了重要工具，但仍存在以下缺陷：

3、（1）忽略中医“证候”：经典的pd模型仅关注“病”（即多巴胺能神经元的损伤），忽视了中医“证”的存在，难以反映pd患者（尤其是中老年患者）普遍存在的“本虚标实”的复杂病理状态，导致基于此类模型的药物筛选结果与临床疗效存在较大偏差；

4、（2）病症结合模型缺乏理论指导与动态模拟：现有的病证结合模型多为两种及以上的造模因素进行机械、静态的叠加，缺乏系统中医理论的指导，而临床上，pd是一个从从脏腑功能衰退开始，逐渐出现病理产物并形成恶性循环的动态过程，但现有模型无法模拟临床pd患者具有的动态、渐进性病理演变过程；

5、（3）评价体系单一：现有模型的评价多集中在行为学和组织病理学检查，缺乏一套评价“病”与“证”的客观、多维量化指标体系，使得模型的“证候属性”难以被科学验证，且现有技术对能够反映中医“证”本质的客观指标关注不足。

6、因此，需要一种新的帕金森动物模型构建方法，遵循“虚气留滞”理论中“虚气为本、留滞为标、虚瘀互结”的病机演变规律，采用“先虚后毒”的时序性复合造模策略，并结合多维评价体系进行验证。

技术实现思路

1、本技术想要解决的问题是提供帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型的构建方法及其应用，基于中医理论，通过时序性复合造模策略，构建一个既能模拟pd核心病理（多巴胺能神经元损伤），又能复现“气虚血瘀”中医证候（能量代谢障碍、微循环紊乱）动态演变过程的动物模型。

2、为了解决上述问题，本技术提供了以下方案：

3、一方面，本技术提供帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型的构建方法，所述构建方法包括：在第一预定时间内每日对动物进行负重力竭训练，然后在第二预定时间内每日对所述动物进行所述负重力竭训练后给药mptp。

4、在上述技术方案中，对动物负重后进行力竭训练，能够使其模拟中医“劳则气耗”的病机，建立元气亏虚的病理基础，第二预定时间中，在力竭训练的同时对动物进行神经毒素mptp的注射，能够模拟“毒邪”侵袭脑络，直接触发多巴胺能神经元损伤的核心病理改变，并与既有的“气虚”状态相互作用，诱发并加剧气血运行障碍，最终形成以“血瘀”为主要表现的“留滞”病理状态。

5、进一步的，所述负重力竭训练的包括在动物尾部施加负重后在22~28℃的水中游泳至力竭状态。

6、示例性地，游泳时的水温优选为25±1℃，水深≥30 cm。

7、示例性地，所述负重为所述动物体重的3%~8%。

8、优选的，所述负重为所述动物体重的5%。

9、在上述技术方案中，负重<3%难以有效诱导“气虚”状态，负重>8%容易导致动物快速溺亡或过度应激。

10、示例性地，所述力竭状态包括动物头部沉没水面下超过10秒且丧失自主上浮能力或捞出后无法在5秒内完成翻正反射。

11、在一些实施例中，所述第一预定时间为7~10天。

12、优选的，所述第一预定时间为7天。

13、在一些实施例中，所述第二预定时间为7~10天。

14、优选的，所述第二预定时间为7天。

15、在上述技术方案中，总造模周期为14~20天，优选为14天，造模周期过短（<14天）容易导致“气虚”不足或“毒损”不够，周期过长（>20天）容易导致动物耐受或mptp慢性毒性而增加非特异性损伤的风险。

16、在一些实施例中，所述mptp的给药量为25~35 mg/kg/天。

17、在一些实施例中，所述mptp的给药方式包括腹腔注射。

18、一方面，本技术提供上述方法得到的帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型。

19、一方面，本技术提供上述方法得到的帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型或上述帕金森病气虚血瘀证病证结合动物模型在筛选或制备治疗帕金森的药物中的应用。

20、另外，模型成功的验证需采用一套涵盖宏观与微观的“病-证”结合多维评价体系，该体系包括以下四个维度：

21、（1）宏观证候评价：对“气虚”指标（如体温、体重、活动能力、弓背、扎堆、精神状态等）和“血瘀”指标（如爪甲、肢端、尾部血管、舌色、舌下脉络颜色与形态等）进行量化，验证标准为：①总分≥8分，②“气虚”维度积分的出现时间明显早于“血瘀”维度积分；

22、（2）行为学评价：通过系列行为学实验评估实验动物的运动功能，验证标准为：动物模型出现严重的行动障碍，如旷场实验中运动总路程、平均速度显著减少，转棒实验中在棒时间显著缩短，爬杆实验中转身及爬下时间显著延长；

23、（3）组织病理学评价：通过检测黑质-纹状体的多巴胺能神经元损伤程度，验证标准为：动物模型的黑质酪氨酸羟化酶（th）阳性神经元数量、尼氏染色存活神经元数量及纹状体th阳性纤维密度均显著降低，反映了机体能量代谢障碍；

24、（4）分子生物学评价：通过检测外周血清及脑组织中的特异性分子指标，作为“气虚”和“血瘀”证候的客观生物学证据，①验证“气虚”时，检测动物模型血清能量代谢指标（如atp/adp比值、camp/cgmp比值）显著降低，②验证“血瘀”时，检测血清微循环指标（如txa2/pgi2比值），验证标准为：动物模型的txa2/pgi2比值显著下降，反映了血管舒缩功能失衡及血小板聚集倾向，③验证“留滞”的微观机制时，检测黑质组织的神经炎症水平，验证标准为：动物模型的胶质细胞标志物（如iba1、gfap）和促炎因子（如il-1α、 il-1β、 il-6、tnf-α等）的mrna表达应显著上调，且抗炎因子il-10代偿性上调受阻，形成促炎-抗炎失衡。

25、本技术具有以下有益效果：

26、（1）本技术动物模型首次在动物水平上系统复现了pd“气虚血瘀”的中医证候特征。模型不仅呈现了黑质th阳性神经元丢失这一典型病理改变，更重要的是，在通过宏观证候量表动态评价后，能够确认本技术成功模拟了临床pd患者从“神疲乏力”（气虚）到“舌下脉络瘀紫”（血瘀）的“因虚致瘀”动态演变过程，为评价益气活血类中药的“方证对应”优势提供了更贴近临床实际的实验载体；

27、（2）本技术与现有静态叠加模型不同，本技术模型“先虚后毒”的时序性设计，首次在实验动物上再现了从“虚-瘀-虚瘀互结”的级联病理过程，通过证候动态分析发现，“气虚”维度积分第2天即显著升高，而“血瘀”维度积分至第8天才出现，这一发现为“虚气留滞”理论提供了直接的实验证据。