一种褪黑素受体1A载脂蛋白E双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法

本发明涉及实验动物模型构建，特别是一种褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法。

背景技术：

1、在代谢心血管疾病领域，载脂蛋白e基因敲除小鼠因内源性脂质清除障碍，经高脂饲料诱导后可自发形成主动脉斑块，已成为国际公认的动脉粥样硬化标准模型。为进一步模拟临床2型糖尿病加速斑块易损的病理特征，现有技术普遍采用apoe单基因敲除小鼠联合链脲佐菌素腹腔注射的化学诱导策略：通常对8-10周龄雄性小鼠禁食后按一定剂量连续注射stz以破坏胰岛β细胞，继以含脂肪15%-45%、胆固醇0.1%-0.25%的高脂膳食饲喂8-16周，从而构建糖尿病合并as复合模型。该方法操作相对简便，能够在一定程度上复现高糖血症与血管脂质沉积的共病状态，并为探索降糖与抗as药物的协同效应提供了初步载体，迄今已产出大量基础医学证据，构成了本领域常规的研究用模型构建手段。

2、基于apoe单基因敲除背景的上述造模方案，在长期实验推行中逐渐显现出特定维度的局限，尤其体现在模型组内表型的一致性与可重复性评价上。由于apoe-/-小鼠本身的基因异质性叠加stz对β细胞损伤程度的个体波动，现有模型在血糖稳态维持及斑块形态量化指标上表现出较高的离散度；具体表现为成模后随机血糖的组内变异系数常居于32%-41%区间，主动脉窦坏死核心面积的变异系数甚至超过46%，右颈动脉相关病理参数的个体偏差可突破80%。这种显著的数据发散迫使研究者不得不扩大样本量以抵消实验误差，既推高了耗材与饲养成本，也削弱了跨批次结论的可比性。尽管通过优化stz给药节奏或微调饲料配比可边际改善均一性，但受制于单一基因缺失背景的代偿上限，现有途径始终难以从根本上压缩关键病理指标的变异幅度。本发明所依托的发明构思，正是鉴于此点不足，旨在引入次级基因修饰以重构代谢-血管交互界面，获取表型收敛的糖尿病as易损斑块模型。

技术实现思路

1、鉴于上述现有存在的问题，提出了本发明。

2、因此，本发明提供了一种褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法解决现有apoe单基因敲除糖尿病动脉粥样硬化模型因基因异质性与stz损伤波动导致的组内表型离散度高、关键病理指标变异系数大且难以从根本上压缩而引发的模型稳定性差与重复性评价困难的问题。

3、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

4、本发明提供了一种褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉硬化造模法，其包括，以c57bl/6j遗传背景的mtnr1a基因纯合敲除小鼠与apoe基因纯合敲除小鼠为亲本进行杂交繁育，筛选获得mtnr1a/apoe双基因纯合敲除小鼠；

5、选取6周龄雄性mtnr1a/apoe双基因纯合敲除小鼠，适应性饲养2周；

6、禁食12h后，按50mg/kg体重每日腹腔注射1次链脲佐菌素柠檬酸溶液，连续注射5天；

7、stz注射完成后2周检测随机血糖确认糖尿病成模情况；

8、饲喂含21%脂肪、0.21%胆固醇的高脂饲料持续12周，诱导形成糖尿病动脉粥样硬化易损斑块；

9、检测血糖、血脂及主动脉与颈动脉病理指标，完成模型鉴定。

10、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：所述杂交繁育具体包括：将mtnr1a纯合敲除小鼠与apoe纯合敲除小鼠杂交获得f1代mtnr1a+/-apoe+/-双杂合子小鼠，再将f1代同胞交配获得f2代，对f2代小鼠尾尖基因组dna进行mtnr1a及apoe基因特异性pcr扩增及琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选mtnr1a-/-apoe-/-双基因纯合敲除小鼠并扩繁保种；同步繁育同龄同性别同背景的apoe单基因敲除小鼠作为对照。

11、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：所述适应性饲养的环境为温度22-25℃、湿度50%-60%，采用12h光照/12h黑暗循环，小鼠自由摄食饮水；所述stz柠檬酸溶液为用0.1mol/l、ph4.5的柠檬酸缓冲液新鲜溶解链脲佐菌素，对照组注射等体积柠檬酸缓冲液。

12、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：stz注射后每两周测定一次随机血糖，当小鼠连续三次随机血糖>16.7mmol/l时判定糖尿病造模成功；高脂饲喂12周后禁食12h，眼眶取血检测空腹血糖及血脂指标。

13、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：所述病理指标检测具体为：剥离心脏至髂动脉的整段主动脉，进行大体油红o染色；分离带主动脉的心脏及右颈总动脉，依次进行油红o染色、h&e染色、masson染色，测定斑块面积、脂质沉积量、脂质坏死核心面积、纤维沉积量及纤维帽厚度，并计算各组内变异系数。

14、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：所得模型与apoe单基因敲除糖尿病动脉硬化小鼠相比，其随机血糖组内变异系数为16.15%~25.76%（单敲除为32.16%~41.19%），空腹血糖值达22.76mmol/l且组内变异系数为19.91%（单敲除均值为16.94mmol/l、变异系数30.88%）。

15、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：主动脉窦h&e染色显示斑块面积比率均值为30.80%、变异系数9.55%，坏死核心面积比率均值21.71%、变异系数23.95%；右颈动脉h&e染色显示斑块面积比率均值79.35%、变异系数21.49%，坏死核心面积比率均值24.85%、变异系数43.81%；均显著高于apoe单敲除对应指标且变异系数更低。

16、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：主动脉窦油红o染色显示脂质沉积面积比率均值16.98%、变异系数17.88%（apoe单敲除为10.96%、变异系数23.76%）；masson染色显示纤维沉积量均值8.05%、变异系数21.78%，纤维帽厚度均值4.85μm、变异系数42.48%（apoe单敲除纤维帽厚7.60μm），呈现薄纤维帽、大坏死芯的易损斑块表型。

17、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：所述的造模法制得的小鼠模型在mtnr1a信号通路调控糖尿病合并动脉粥样硬化易损斑块形成机制研究。

18、作为本发明所述褪黑素受体1a载脂蛋白e双敲除糖尿病动脉粥样硬化造模方法的一种优选方案，其中：所述的造模法制得的小鼠模型在筛选及评价降糖、抗动脉粥样硬化、稳定易损斑块候选药物或干预靶点验证。

19、本发明有益效果为：通过以c57bl/6j背景的mtnr1a与apoe纯合敲除鼠为亲本进行杂交及pcr电泳基因型筛选，实现了双基因缺失遗传背景的标准化构建，消除了单基因模型的代偿冗余，为代谢-血管交互研究提供了均一性优良的宿主平台；通过选取雄性双敲除鼠适应性饲养后按既定剂量连续腹腔注入stz并衔接高脂成分饲料长程饲喂，配合时序化血糖监测与多染色病理鉴定，实现了糖尿病高血糖稳态与动脉粥样硬化易损斑块的同步诱导，精准复刻了薄纤维帽、大坏死芯的临床高风险表型；上述步骤级联作用，使得模型在糖代谢及斑块形态学上的组内离散度被根本性压缩，显著削减了实验样本需求与跨批差异，最终达到了以高稳定性、高重复性的双敲除造模体系支撑发病机制解析、靶点验证及降糖抗as药物筛选。