一种烟草原生质体蛋白质组的提取和检测方法与流程

技术特征：
1.一种烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法，其特征在于，该方法以烟草原生质体为提取对象，具体包括如下步骤：（一）备料按照现有技术，以烟草叶肉细胞为原料，制备烟草原生质体备用；（二）细胞裂解将原生质体样品溶于十二烷基硫酸钠缓冲液中，超声破碎；破碎后，加入预冷的丙酮，在-20℃条件下沉淀4小时以上；（三）获得全蛋白将步骤（二）中沉淀处理后混合液进行离心，弃上清，并用预冷丙酮清洗后，用重悬液进行重悬，再次超声处理后，离心收集获得全蛋白；（四）检测取步骤（三）中所提取全蛋白样品，烷基化处理后，胰蛋白酶消化酶解，并利用hlb固相萃取柱对消化酶解后肽段进行提纯；检测时，根据数据采集方式不同可分为：数据依赖采集dda方法和数据非依赖采集dia方法；具体而言：数据依赖采集( dda)方法：流动相a：0.1%甲酸
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ms水；流动相b：0.1%甲酸
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ms can；线性梯度：分析过程中，选择响应值最大的30-50个离子进行二级采集；tof-ms的质量范围为350 ~ 1250 m/z，高分辨率模式(> 2.5万)，采集时间为250 ms；加热后毛细管的喷雾电压设置为2.5 kv，温度设置为150℃；数据非依赖采集( dia)方法：lc参数条件与上述条件相同；构建了80个动态窗口，质量范围350 ~ 1500 da，离子积累时间为20-50 ms。2.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法，其特征在于，步骤（一）中，所述烟草原生质体为cd处理后原生质体。3.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法，其特征在于，步骤（二）中，所述超声破碎为：60%的功率超声30-60秒进行破碎。4.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法，其特征在于，步骤（三）中，所述重悬液：重悬液中含有6-8 m尿素和50 mm碳酸氢铵；具体操作为：将步骤（二）中沉淀处理后混合液在4℃条件下，13000-20000 g离心5-20分钟，留沉淀；
用1毫升预冷丙酮对沉淀进行重悬清洗后，4℃、13000-20000 g离心5-20分钟；留沉淀；将沉淀物用1-3 ml重悬液进行重悬，并进行超声处理；超声处理结束后，4℃、13000-20000 g离心5-20分钟，收集所得即为全蛋白。5.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法，其特征在于，检测前对所提取全蛋白的具体处理操作为：（1）将全蛋白与终浓度5 mm的二硫苏糖醇 dtt混合均匀后，56℃条件下孵育30 min；然后用40 mm碘乙酰胺iaa 在黑暗条件下将蛋白质烷基化处理30 min；再后补加dtt至终浓度10 mm，并继续黑暗条件下处理10min；（2）将上述蛋白质烷基化后样品用50 mm碳酸氢铵稀释后，加入胰蛋白酶，摇床上37
°
c酶解消化处理12-24小时；以质量比计，蛋白：胰蛋白酶=25-50:1；（3）对步骤（2）中消化后样品，利用hlb固相萃取柱 (spe)进行脱盐处理，并用1%三氟乙酸tfa对所得多肽样品进行洗涤；最后，用1-3 ml 80% 乙腈 acn 和0.1% tfa从hlb固相萃取柱spe洗脱样品，干燥。

技术总结
本申请属于植物生理学技术领域，具体涉及一种烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法。该方法以烟草原生质体为提取对象，具体包括：制备烟草原生质体、细胞裂解、获得全蛋白、检测等步骤。本申请中，基于烟草蛋白质组研究需要，发明人对烟草蛋白质组提取方法和检测方法进行了优化，并结合相关非生物因素胁迫处理，对烟草蛋白质成分变化情况进行了初步研究。结果表明，本申请所提供的提取方法和检测方法，灵敏度较高，可有效支撑代谢蛋白质组研究应用，从而可为相关分子调节通路研究、基因功能研究奠定良好的技术基础，表现出较好的实用价值。用价值。


技术研发人员：权利要求书2页说明书6页附图3页
受保护的技术使用者：中国烟草总公司郑州烟草研究院
技术研发日：2022.08.24
技术公布日：2022/11/11