一种基于标志性成分的林下参质谱鉴别方法与流程

本发明涉及中药材鉴别，尤其是涉及一种基于标志性成分的林下参质谱鉴别方法。

背景技术：

1、人参 panax ginseng c. a. mey. 为五加科植物的干燥根和根茎，收载于 2025版《中华人民共和国药典》，是我国传统名贵中药材。根据生长环境与培育方式的不同，人参分为两类：人工农田集约化栽培的品种俗称“园参”，生长周期短、产量高；播种于山林野生环境、自然生长的品种称“林下山参”（习称“籽海”），生长周期长、品质更优，药用价值与市场价格远高于园参。现代研究表明，人参的主要活性成分为人参皂苷类化合物，同时包含多糖、挥发油、氨基酸、黄酮等多种功效成分。现代药理研究证实，人参及其活性成分具有多靶点、多通路的药理作用，涵盖增强机体免疫、抗疲劳、抗氧化应激、抗肿瘤、改善心脑血管功能、调节中枢神经、保护肝肾功能、延缓衰老等多个方面，在医药、保健品、化妆品等领域具有极高的应用价值。

2、因生长周期和生境差异导致品质悬殊，仅凭传统外观性状极难辨别。由于林下山参与园参在基原与共有化学成分上高度同源，尽管现有研究尝试利用 hplc、质谱等技术进行鉴别，但多聚焦于常规皂苷成分，缺乏能精准区分二者的特异性标志性成分，也未建立基于微积分定量的标准化判别模型，无法实现对林下参与园参的快速、准确与量化鉴别，因此，亟需开发一种高特异性的检测方法来规范市场与保障药材质量。

3、现有检测技术主要包括四类：一是采用hplc指纹图谱结合聚类分析、主成分分析等化学计量学方法，以人参皂苷 rg1、re、rb1、rc、rb2、rd 等常见成分为指标进行分类鉴别；二是采用uplc-q-tof-ms等高分辨质谱开展非靶向代谢组学分析，通过opls-da模型筛选rb1、rg1、rb2、ro、rg3等差异皂苷作为潜在标志物；三是采用近红外光谱、显微红外光谱结合数据预处理与模式识别算法，实现粉末样品的快速无损判别；四是采用总皂苷、单体皂苷含量、乙醚浸出物、参粉密度等常规理化与物理指标作为辅助鉴别依据。上述方法普遍存在明显缺陷：均依赖林下参与园参共有的成分、光谱或理化指标，缺少专属且特异性强的标志性成分，导致判别边界模糊、易误判；对微量差异成分仅采用常规峰面积积分，未使用微积分算法实现精准定量，检测灵敏度与重复性不足；判别结果易受产地、参龄、样品状态、仪器型号等外界因素干扰，稳定性与通用性差；各类指标在两类参中重叠范围大，仅能作为辅助参考，且未形成“标志物确定—精准定量—阈值判定”的标准化体系，难以在实际监管与质检场景中规模化应用。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供检测标志性成分组合物的物质在鉴别林下参或制备用于鉴别林下参的产品中的应用，以解决现有技术中因产地混杂、参龄模糊、加工干扰导致样品无法准确鉴别的技术问题。

2、本发明的目的之二在于一种林下参的质谱鉴别方法。

3、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供了检测标志性成分组合物的物质在鉴别林下参或制备用于鉴别林下参的产品中的应用；

5、所述标志性成分组合物包括西洋参皂苷jb异构体、三七皂苷c异构体、西洋参皂苷l2、竹节参皂苷vi和人参皂苷rd。

6、进一步的，所述检测标志性成分的物质包括标志性成分对应的标准品物质，和/或，用于溶解标准品物质、待测样品及非林下参对照样品中标志性成分的有机溶剂；

7、优选地，所述有机溶剂包括甲醇。

8、进一步的，所述产品包含检测标志性成分的物质；

9、优选地，所述产品包括试剂和/或试剂盒。

10、第二方面，本发明提供了一种林下参的质谱鉴别方法，包括高效液相色谱和质谱联用法分别对待测样品溶液和非林下参对照样品溶液中上述的标志性成分进行检测，获得各样品溶液中每个标志性成分的归一化峰面积，按照以下公式分别计算待测样品中每个标志性成分的判定比例：

11、；

12、r标志性成分为标志性成分的判定比例，s待测样品为标志性成分在待测样品中的归一化峰面积，s非林下参对照样品为标志性成分在非林下参对照样品中的归一化峰面积；

13、若每个标志性成分的r标志性成分均≥60%，则待测样品为林下参，否则为非林下参。

14、进一步的，获得各样品溶液中每个标志性成分的归一化峰面积包括将各样品溶液中所有检出的质谱峰的峰面积总和设为100%，将标志性成分对应的质谱峰的峰面积按比例换算为百分比数值得到。

15、进一步的，所述非林下参对照样品包含至少一种非林下参样品；

16、优选地，当非林下参对照样品包含两种或两种以上非林下参样品时，s非林下参对照样品为标志性成分在全部非林下参样品中的归一化峰面积的算术平均值。

17、进一步的，所述待测样品溶液和非林下参对照样品溶液的制备方法包括将样品提取物溶于有机溶剂，过滤即得；

18、优选地，所述有机溶剂包括甲醇；

19、优选地，所述样品提取物的制备方法包括取样品粉末，经醇提，离心取上清，冷冻干燥获得。

20、进一步的，色谱柱为键合有c18烷基链的硅胶基质，优选地为反相c18色谱柱；

21、优选地，流动相a为乙腈，流动相b为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，进样量为2μl。

22、进一步的，梯度洗脱包括：

23、0~2min：2%~25%流动相a、98%~75%流动相b；

24、2~7min：25%流动相a、75%流动相b；

25、7~9min：25%~30%流动相a、75%~70%流动相b；

26、9~18min：30~40%流动相a、70%~60%流动相b；

27、18~21min：40%~75%流动相a、60%~25%流动相b；

28、21~21.5min：75%~95%流动相a、25%~5%流动相b；

29、21.5~24min：95%流动相a、5%流动相b；

30、24~24.5min：95%~2%流动相a、5%~98%流动相b；

31、24.5~30min：2%流动相a、98%流动相b；

32、优选地，流速为0.2~0.4 ml/min，优选为0.3 ml/min；

33、优选地，柱温为25~35℃，优选为30℃。

34、进一步的，质谱条件包括：电喷雾离子源（esi），正负离子模式分别扫描，扫描范围为100~1500m/z；毛细管电压：正离子模式时为3.0 kv，负离子模式时为2.5 kv；离子源温度为150℃；脱溶剂气温度为500℃。

35、本发明提供的检测标志性成分组合物的物质在鉴别林下参或制备用于鉴别林下参的产品中的应用，首次确证5个标志性成分在林下参中的含量显著高于其他非林下参类，可作为区分林下参和非林下参的专属标志物，提升准确率和抗干扰能力，避免交叉误判；该标志性成分组合物突破了传统以“含量差异”为判据的共有成分分析范式，转而依托物代谢特异性，解决了现有技术中因产地混杂、参龄模糊、加工干扰导致样品无法准确鉴别的技术问题。结合质谱检测与质谱数据归一化建立微量成分精准定量方法，形成“标志物定性—质谱数据归一化—判定阈值”一体化标准化鉴别体系，提供一套专属性强、准确度高、稳定可靠、可批量应用的林下参鉴别方法，以规范人参市场秩序、遏制以次充好与年份造假行为，切实保障消费者权益与人参药材质量。解决了现有技术中因依赖共有成分、定量粗糙、无专属标志物、判别体系不统一而导致的误判率高、难以监管落地的技术问题。