一种脊髓组织冰冻切片的制备方法与流程

本发明涉及生物医学实验，尤其是涉及一种脊髓组织冰冻切片的制备方法。

背景技术：

1、脊髓损伤是常见的中枢神经损伤性疾病，常致患者瘫痪，严重影响患者的身心健康。大鼠脊髓损伤模型通过外力作用于脊髓组织，在体外模拟人类脊髓损伤疾病，可以为脊髓损伤的相关治疗研究提供理论依据。

2、冰冻切片是一种低温下使组织快速冷却到一定硬度并进行切片的方法，无需经过甲醇、二甲苯等有机试剂的处理，组织没有收缩，易保持原有形态，能较好地保存细胞抗原的活性，是保存神经组织中抗原和酶活性的理想切片方法。

3、然而，目前基于脊髓组织的冰冻切片制备方法由于脱水不充分或包埋支撑不足，普遍存在组织破碎、重叠、细胞变形等问题，严重影响了对脊髓组织进行的组织学分析，也阻碍了进一步对脊髓组织的观察。

4、因此，为了制备出平整的脊髓组织冰冻切片，亟待开发一种脊髓组织冰冻切片的新型制备方法。

技术实现思路

1、本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种脊髓组织冰冻切片的制备方法。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

3、本发明提供一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

4、s1、脊髓组织的固定：

5、将离体的脊髓组织浸入多聚甲醛溶液中进行固定，得到固定处理后的脊髓组织；

6、s2、脊髓组织的脱水与处理：

7、采用浓度梯度上升的蔗糖溶液对固定处理后的脊髓组织进行梯度脱水；

8、采用无水乙醇进行脱水；

9、将脱水后的脊髓组织浸泡在纯牛奶中；

10、将浸泡在纯牛奶中的脊髓组织取出并吸干牛奶和水分，随后浸泡在oct包埋剂中；

11、s3、脊髓组织的包埋：

12、在包埋盒的底部铺设oct包埋剂，冷冻待用；

13、将步骤s2处理后的脊髓组织置于包埋盒中，补加oct包埋剂至没过脊髓组织后进行冷冻，获得冰冻切片用的oct包块；

14、对oct包块进行切片，最终获得脊髓组织冰冻切片。

15、进一步地，步骤s1中，所述离体的脊髓组织来源于实验大鼠或实验小鼠。

16、进一步地，步骤s1中，所述多聚甲醛溶液的浓度为4%，固定的温度为2-5 ℃，固定的时间为18-30 h。

17、进一步地，步骤s2中，所述蔗糖溶液的浓度依次为20%和30%，每次脱水的温度均为2-5 ℃，脱水的时间为18-30 h。

18、进一步地，步骤s2中，采用无水乙醇进行脱水的温度为2-5 ℃，脱水的时间为1-3min。

19、进一步地，步骤s2中，浸泡在纯牛奶中的温度为2-5 ℃，浸泡的时间为1-3 h。在牛奶浸泡时间上，牛奶浸泡的时间以2小时为佳。浸泡时间过短，牛奶渗透不足，仍出现局部碎裂；浸泡时间过长，会影响切片效率且成片质量并未显著提升。

20、进一步地，步骤s2中，所述纯牛奶为全脂纯牛奶，脂肪含量为3.2-3.8 g/100 ml。。全脂牛奶中富含脂质成分（如甘油三酯）有助于维持细胞膜稳定性，并在组织表面形成保护层，从而提升抗剪切的能力。

21、进一步地，步骤s2中，浸泡在oct包埋剂中的时间为1-3 h。

22、进一步地，步骤s3中，将步骤s2处理后的脊髓组织前后对齐、依次排列放置，相邻脊髓组织之间留有间隙。

23、进一步地，步骤s3中，所述包埋盒中包埋的层数为1-2层。包埋盒中包埋的层数可根据脊髓组织的数量进行适应性调整。数量少可以只包埋一层，数量多可以包埋两层；但是不建议包埋三层或者更多的脊髓组织，脊髓组织过多切片时容易卷，切出的脊髓组织切片质量不佳。

24、更进一步地，当需要包埋两层脊髓组织时，两层脊髓组织的摆放位置、方向相同。

25、进一步地，步骤s3中，所述冷冻的温度均不高于-75 ℃，优选为置于-80 ℃冰箱中冷冻；冷冻的时间均为20-40 min。

26、与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：

27、（1）本发明在脊髓组织的脱水过程中，首先采用蔗糖溶液和无水乙醇进行脱水，能有效减少脊髓组织冰冻切片中冰晶的产生；且在脱水完成后将脊髓组织放入牛奶中浸泡，能增加脊髓组织的弹性，大大减少了脊髓组织冰冻切片过程中组织破碎的情况；在牛奶浸泡后，将脊髓组织放入oct包埋剂中浸泡，能够增加脊髓组织与oct包埋剂的亲和性，减少了切片过程中脊髓组织与oct包埋剂分离及组织重叠的现象。最终成功制备出了完整且平整的脊髓组织的冰冻切片，解决了现有脊髓组织冰冻切片方法中存在的组织破碎、重叠、细胞变形等问题。

28、（2）本发明通过引入纯牛奶作为预处理介质，利用其中富含的酪蛋白、乳清蛋白及脂肪成分，在组织表面形成一层温和的保护膜；同时部分渗透进入细胞间隙，缓冲脱水过程中的张力变化，减少蔗糖梯度脱水带来的快速失水效应，防止组织收缩不均；增强细胞间连接强度，蛋白质分子可能与细胞外基质相互作用，提升组织整体韧性；改善oct渗透性，牛奶中脂类有助于降低界面张力，促进oct更均匀地包裹组织，提高包埋质量。

29、（3）本发明在包埋的过程中可一次性包埋多层、多根脊髓组织，大大节约了进行脊髓组织连续切片时的工作时间。

1.一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述多聚甲醛溶液的浓度为4%，固定的温度为2-5 ℃，固定的时间为18-30 h。

3.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述蔗糖溶液的浓度依次为20%和30%，每次脱水的温度均为2-5 ℃，脱水的时间为18-30h。

4.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，采用无水乙醇进行脱水的温度为2-5 ℃，脱水的时间为1-3 min。

5.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，浸泡在纯牛奶中的温度为2-5 ℃，浸泡的时间为1-3 h。

6.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述纯牛奶为全脂纯牛奶，脂肪含量为3.2-3.8 g/100 ml。

7.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s2中，浸泡在oct包埋剂中的时间为1-3 h。

8.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s3中，将步骤s2处理后的脊髓组织前后对齐、依次排列放置，相邻脊髓组织之间留有间隙。

9.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述包埋盒中包埋的层数为1-2层。

10.根据权利要求1所述的一种脊髓组织冰冻切片的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述冷冻的温度均不高于-75 ℃，冷冻的时间均为20-40 min。