双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用

本发明涉及生物分析领域，具体涉及一种双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用。

背景技术：

1、同源重组由一系列保守的同源重组酶催化完成，包括噬菌体的t4 uvsx，古细菌的rada，细菌的reca，以及真核生物的rad51和dmc1等。在真核生物中，rad51主要负责dna双链断裂的同源重组修复过程，而dmc1特异性地催化减数分裂过程中的同源重组。同源重组步骤繁多，需要多种蛋白质机器的参与，并受到精细的调控，其生物化学过程大致可以分为以下四个阶段：起始阶段、同源配对阶段、新链合成阶段和分离阶段。同源重组是生命起源、生物多样性以及疾病发生发展的分子基础，其各个精细过程的研究是当今的生命科学前沿领域。发展新的光学分析与研究手段是回答同源重组中重要科学问题的关键。

2、由于传统的分析技术获得的信息是基于所有分子测量的平均结果，大量特异的个体信息被掩盖，其难以揭示同源重组等许多复杂的生物学过程。而在基本的生命过程中，许多生物大分子都是通过单个或数个分子执行其特定功能。因此，在单分子水平上观测目标分子的结构与行为对于我们理解基本的生命过程至关重要。

3、目前，已发展出多种单分子测量技术，大致可以分为两类：一是基于荧光及其光谱学的成像技术，主要包括单分子荧光成像技术(single-molecule fluorescence imaging)和单分子荧光共振能量转移技术(single-molecule fluorescence resonance energytransfer，smfret)；二是基于力学的操纵和检测技术，主要包括光镊、磁镊和原子力显微镜等。

4、光学显微镜是生物医学领域不可或缺的研究工具，在基础研究与临床诊断中都发挥了重要作用。通过显微成像，我们不仅可以获得目标分子的存在及位置信息。由于荧光的发射波长比吸收波长更长，通过合理的光路设计，可以大幅降低背景的干扰，从而成为单分子成像的最佳选择。目前，现有的光学显微镜，对于观察短暂存在的中间状态或不稳定状态无法进行精确测量，也难以同时获得两种或多种荧光信号并对其进行分析。

技术实现思路

1、基于此，本发明提出了一种双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用，可在单分子水平实现对两个相互作用分子的动态或者一个双链dna分子两条互补链的配对与分离的实时检测与定量表征。

2、根据本发明的第一个方面，提供了一种双色激光交替激发单分子成像检测装置，包括：双色激光交替激发器，用于激发两束不同波长的第一激发光和第二激发光作为激发光源；声光可调谐滤波器，适用于控制两束不同波长的第一激发光和第二激发光交替激发形成交替激光并将所述交替激光耦合至一根光纤内；载物平台，包括微流室，用于放置第一目标样品和第二目标样品，上述第一目标样品由第一荧光染料标记，上述第二目标样品由第二荧光染料标记，在上述第一激发光照射期间，激发上述第一荧光染料，使得上述第一荧光染料发射出第一荧光信号，且当上述第一荧光染料与上述第二荧光染料之间的距离满足共振能量转移条件时，产生荧光共振能量转移信号，在上述第二激发光照射期间，激发上述第二荧光染料，使得上述第二荧光染料发射出第二荧光信号；荧光检测组件，用于接收上述荧光共振能量转移信号、上述第一荧光信号和上述第二荧光信号，并通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像，并通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像；其中，上述交替激光在所述载物平台上利用全内反射形成隠逝场以降低背景光干扰。

3、根据本发明的实施例，上述微流室包括：由载玻片和peg修饰的盖玻片组合成的用于样品留存的腔室，上述微流室的高度为胶连接结构的高度；其中，上述载玻片包括进样孔和输出孔，上述输出孔通过导管连接有注射器。

4、根据本发明的实施例，上述微流室内包括：目标分子，包括被第一荧光染料标记的探针分子与被第二荧光染料标记的靶分子；成像缓冲液，用于引入目标分子，还包括用于抑制荧光基团三重态闪烁和光漂白的除氧系统和还原剂组成，上述成像缓冲液的成分包括d-葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和水溶性维生素e。

5、根据本发明的实施例，其中，还包括倒置荧光显微镜，上述倒置荧光显微镜设置于上述载物平台下侧，用于将上述交替激光聚焦于上述载物平台的盖玻片，或将上述荧光共振能量转移信号、上述第一荧光信号和上述第二荧光信号从上述载物平台引出；照明器，通过光纤与所述声光可调谐滤波器连接，用于接收来自所述声光可调谐滤波器的交替激光，并发射所述交替激光激发上述第一荧光染料或者上述第二荧光染料。

6、根据本发明的实施例，上述双色激光交替激发器包括：激发光源，用于发出两束不同波长的上述激光；反射镜和二向色镜，用于将上述激光源发出的激光反射进上述光路中；透镜，用于将两束上述激光聚焦至上述声光可调谐滤波器。

7、根据本发明的实施例，上述荧光检测组件包括：二向色镜，用于分离上述荧光共振能量转移信号，得到两种不同波长的荧光激光；两个单波段滤光片，平行设置于电子倍增电感耦合器件和上述二向色镜之间，用于过滤上述荧光激光的噪音。

8、根据本发明的第二个方面，提供了一种上述的双色激光交替激发单分子成像检测装置在鉴定生物链交换过程中目标分子的捕获与反应的启动中的应用。

9、根据本发明的实施例，包括以下方面的应用：双链dna分子或rna分子的链分离检测；一个单链dna分子与一个双链dna中互补链的重组反应检测；一个单链rna分子与一个双链dna中互补链的重组反应检测；重组反应检测或链分离检测中的dna链的捕获、反应的启动与结束等过程的准确鉴定；两个单链dna分子或单链rna分子间的杂交反应检测；一个单链rna分子与一个单链dna分子间的杂交反应检测；单链rna分子或dna分子的构象与折叠实时动态分析与检测；单个核酸适配体分子的构象与动态分析；单个核酸适配体分子与靶蛋白结合的动态分析；以核酸适配体分子作为亲和配体和单分子信号传导，高灵敏检测蛋白质和其它靶分子；或以抗体和其它亲和蛋白作为配基，高灵敏检测其它分子，如蛋白质、dna、rna、各种小分子化合物。

10、根据本发明的第三个方面，提供了一种使用上述的双色激光交替激发单分子成像检测装置的方法，包括：通过双色激光交替激发器激发两束不同波长的激光，作为激发光源；通过声光可调谐滤波器使两束上述激光形成用于激发目标分子的交替激光；通过光纤接收来自上述声光可调谐滤波器的交替激光；通过照明器发射上述交替激光激发载物平台中的第一荧光染料或者第二荧光染料；上述交替激光在上述载物平台进行全反射后，在上述载物平台上形成隠逝场，激发上述第一荧光染料或者上述第二荧光染料，以使得上述第一荧光染料与上述第二荧光染料之间形成荧光共振能量转移信号，或者使得上述第一荧光染料激发出第一荧光信号，或者使得上述第二荧光染料激发出第二荧光信号；通过荧光检测组件接收上述荧光共振能量转移信号、上述第一荧光信号和上述第二荧光信号；通过电子倍增电感耦合器件感应形成目标图像。

11、根据本发明的实施例，上述通过荧光检测组件接收上述荧光共振能量转移信号包括：通过二向色镜分离两种上述荧光共振能量转移信号；通过平行设置的单波段滤光片过滤上述荧光共振能量转移信号中的噪音。

12、从上述技术方案可以看出，本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置、使用方法和应用具有以下有益效果：

13、本发明提供的双色激光交替激发单分子成像检测装置，可在单分子水平上实现对两个相互作用分子的动态或者一个双链dna分子两条互补链的配对与分离的实时检测与定量表征。已成功应用于同源重组过程的链交换实时分析，并可以排除dna链交换事件中的假阳性结果。另外，该装置提高了对单分子荧光共振能量转移(smfret)的准确测量，可识别极低的smfret状态。可以用于同源重组等重要生物过程中的生物分析、检测与成像技术以及单分子动态研究。