用于活体组织和类器官药效评估的荧光微针、阵列及其制备方法

本发明属于药效评估，尤其涉及用于活体组织和类器官药效评估的荧光微针、阵列及其制备方法。

背景技术：

1、药物的临床前研究是评估候选化合物有效性与安全性的关键环节，被视为药物进入临床试验及最终获批上市的重要前提。《fda现代化法案2.0》正式签署生效后，不再强制要求新药临床前测试采用动物实验，允许用人源性类器官、组织等体外模型替代。人源性类器官包含多种分化细胞类型并维持着与体内组织相似的空间拓扑结构，组织或类器官中不同功能种类和不同空间区位上的细胞对药物的敏感性存在显著差异。例如，肿瘤类器官或肿瘤组织中外周非癌组织细胞和核心癌细胞对治疗药物敏感性存在明显区别，此外，肿瘤组织内固有的细胞异质性导致不同细胞亚群对抗癌药物的反应谱呈现显著多样性。然而现有研究多聚焦于类器官或组织等3d生物模型的整体药效响应，未能充分考虑其固有的细胞异质性特征及空间药代动力学差异。忽略这种细胞异质性和空间异质性将降低药效评估的准确性和真实性，难以精准反映药物在体内环境中对组织器官的实际治疗效果。例如，微孔阵列与微液滴约束等物理隔离技术结合微流控技术构建的类器官芯片系统，虽然实现了对多个类器官样本的长期、多参数、原位监测，能够获取其药物反应过程中的多维度动态信息。但上述方法仅能反映组织或类器官在整体水平的活性变化，无法揭示其内部细胞异质性及活性在空间分布上的差异，从而限制了对类器官复杂生物学行为的深入解析。

2、针对类器官开发的集成可拉伸纳米电子器件通过在类器官发育的早期阶段将柔性电子器件集成到类器官内部，可以实现对类器官生理功能的长期、连续、三维监测，但是该方法在类器官内可能干扰类器官的自然发育，且主要局限于电生理等物理信号的监测，难以全面捕捉药物引发的复杂生化变化。流式细胞术结合pi/annexin v/7-aad等死亡标记方法，通过机械或酶解裂解获得单细胞悬液，进而量化细胞类型特异性存活率并解析凋亡通路，该种终点检测法彻底破坏组织或类器官的三维结构无法获取空间维度信息，且单次采样无法捕捉时间维度信息。质谱成像和磁共振成像技术虽然具有高空间分辨率且可达亚细胞级别，可对药物在组织或类器官内的空间分布进行可视化、定位、定量分析，但这两种方法需要对组织或类器官进行切片处理后检测，同样只能反映某一时刻的药物活性，无法长期跟踪、实时监测。而基于代谢活性的检测策略，例如atp荧光素酶检测与calcein am活性标记法，虽无需破坏组织/类器官结构即可实现代谢活性相关分子的定量分析，但检测试剂可能对细胞造成不可逆损伤干扰真实生理状态，且信号随时间衰减，难以实现长时间动态监测。

3、因此，亟需开发一种用于类器官或组织药物活性、有效性时空分辨评估的方法，以实现精确的药代动力学建模和作用机制阐明，从而推动临床前药效评估范式的革新。

技术实现思路

1、本发明的目的为：在不破坏活体组织和类器官完整性的前提下，实时获得活体组织或类器官中不同位置、不同类型细胞在不同时刻的代谢活性和对药物的响应情况。

2、本发明的技术方案为：

3、一种用于活体组织和类器官药效评估的荧光微针，所述荧光微针的针尖的尖端部为代谢物响应区，所述代谢物响应区直径为0.5-40 μm、长度为0.5-20 μm；所述代谢物响应区富集有荧光探针，所述荧光探针为对待测代谢物具有可逆响应性能的荧光染料。

4、本发明的荧光微针，针尖的尖端部的代谢物响应区直径为0.5-40 μm、长度为0.5-20 μm，这样的荧光微针的尖端仅能响应位于微针尖端附近的1-8个细胞中的代谢物，从而实现细胞级别上对药物的响应，精准揭示活体组织和类器官内部细胞异质性及活性在空间分布上的差异，反映药物在体内环境中对组织器官的实际治疗效果，并且不破坏活体组织和类器官完整性。由此种荧光微针制成的荧光微针阵列可以实时获得活体组织或类器官中不同位置、不同类型细胞在不同时刻的代谢活性和对药物的响应情况。

5、优选地，所述代谢物响应区以外区域不含荧光探针。使用这样的荧光微针在对活体组织或类器官检测时，可以根据需要将不同荧光微针的针尖刺入不同的深度。此时，相对于刺入较浅部位的荧光微针，针尖位于较深部位的荧光微针尽管接触到了更多的细胞，但由于代谢物响应区以外没有荧光探针，也就不会对代谢物响应区以外的细胞代谢物响应，也就是说不会对较浅部位的、非检测部位细胞的代谢物发生响应，因此能避免非检测部位细胞对测试结果造成干扰，从而实现空间位置上的精准检测。因此，使用本发明的上述微针，可以制成具有不同刺入长度的微针的微针阵列，以满足具有不同检测深度的多层次的检测需要，也可以制成具有相同长度微针的微针阵列，以满足检测同一水平面不同位置的检测需要。

6、优选地，所述代谢物响应区含有参比荧光染料，所述参比荧光染料为对所述待测代谢物无响应性能的荧光染料。

7、在代谢物响应区加入参比荧光染料，可以归一化校准荧光强度，避免因荧光探针的量或测试仪器参数不一致导致在相同环境中各微针荧光强度不一致的情况。加入参比荧光染料时使用“响应性染料荧光强度/参比染料荧光强度”这一荧光比值ratio来代替荧光强度信号，使荧光染料量不同或测试仪器参数不一致情况下ratio值仍然一致，从而提高了检测的准确性和可靠性。若所选用的荧光探针具有较长的荧光寿命，亦可在不适用参比荧光染料的情况下，直接采用荧光/磷光寿命成像技术实现测量；对荧光寿命<10 ns的荧光探针，亦可采用双荧光寿命参比法进行精准定量测量。

8、优选地， 所述荧光微针的基质材料具有透明和导光的特性，且其折射率>1.4。这样，能够在荧光微针内部形成全内反射结构，将激发光在较少损耗的情况下导入微针尖端，激发荧光染料并将产生的荧光信号导出到检测器中，所述荧光染料包括所述荧光探针和所述参比荧光染料。

9、优选地，所述待测代谢物为氧气、氢离子、二氧化碳、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、三磷酸腺苷、乳酸、葡萄糖、谷胱甘肽、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子或氯离子。

10、对氧气有响应的荧光染料包括但不限于八乙基卟吩铂等金属铂、钯、钌、铱的卟啉或卟吩配合物氧敏感荧光染料。对氢离子响应的荧光染料包括但不限于2-(4-氨甲酰基苄基)-6-((4-(二氯氨基)苯乙基)氨基)-1h-苯并[de]异喹啉-1,3(2h)-二酮、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、异硫氰酸荧光素酯等荧光素类、罗丹明类、香豆素类氢离子响应荧光染料等。对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸响应的荧光染料包括但不限于3-（（6-羟基-2，3-二氢-1h-苯并[a]咔唑-1-亚基）甲基）-2-甲基-1-丙基-1h-苯并[d]咪唑-3-鎓等荧光染料。对三磷酸腺苷响应的荧光染料包括但不限于罗丹明6g三亚乙基四胺等荧光染料。对谷胱甘肽响应的荧光染料包括但不限于(e)-n-(7-氨基-10-(4-羧基-2-甲基苯基)-5,5-二甲基二苯并[b,e]硅烷-3(5h)-亚叉基)甲胺2,2,2-三氟乙酸酯等荧光染料。对钠离子响应的荧光染料包括但不限于2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-((6-(3-甲氧基-4-(1,4,7,10-四氧杂-13-氮杂环十五烷-13-基)苯乙氨基)-1,3-二氧代-1h-苯并[de]异喹啉-2(3h)-基)甲基)苯甲酸酯等荧光染料。对钾离子响应荧光染料包括但不限于4,4′-[1,4,10,13-四氧杂-7,16-二氮杂环十八烷-7,16-二基双(5-甲氧基-6,2-苯并呋喃二基)]-1,3-苯二甲酸四[(乙酰氧基)甲基]酯等荧光染料；对钙离子响应的荧光染料包括但不限于2-[6-[双(2-乙酰氧甲氧基-2-氧代乙基)氨基]-5-[2-[2-[双(2-乙酰氧甲氧基-2-氧代乙基)氨基]-5-甲基苯氧基]乙氧基]-2-苯并呋喃基]-5-噁唑羧酸乙酰氧甲酯等荧光染料；对氯离子响应荧光染料包括但不限于n,n'-双(羧丙基)-9,9'-双吖啶等荧光染料；对镁离子响应荧光染料包括但不限于n-[4-[6-(乙酰氧甲氧基)-2,7-二氟-3-氧代-3h-氧杂蒽-9-基]-2-[2-(乙酰氧甲氧基)-2-氧代乙氧基]苯基]-n-[2-(乙酰氧甲氧基)-2-氧代乙基]甘氨酸乙酰氧甲酯等荧光染料。

11、所述参比染料包括但不限于10-(3-羧丙基)-5,5-二氟-1,3,7,9-四甲基-5h-二吡咯并[1,2-c:1',2'-f] [1,3,2]二氮硼-n-琥珀酰亚胺基酯、4,4'-双(2-苯并噁唑基)二苯乙烯、罗丹明异硫氰酸酯等罗丹明类和香豆素类荧光染料。

12、本发明还提供一种荧光微针阵列，包括上述用于活体组织和类器官药效评估的荧光微针。本发明的荧光微针阵列，当将活体组织或类器官置于微针阵列上时，对于组织器官三维立体结构，在不同区域的微针可接触到不同深度、不同空间分区的细胞，从而在不破坏活体组织或类器官完整性的情况下，直接测量活体组织或类器官不同位置、不同类型细胞的代谢活性及对药物的响应。可利用比率荧光成像或者荧光寿命成像检测荧光信号，得到待测代谢物的浓度数据。由于所采用的荧光纳米探针对待测的代谢物具有完全可逆、且高灵敏度的响应性以及快速响应代谢物浓度变化的能力，该微针阵列可以获得活体组织或类器官中不同位置、不同类型细胞在不同时刻的代谢活性和对药物的响应情况。这种具有时空分辨能力、并且在不破坏活体组织或类器官完整性情况下获得活体组织或类器官中不同位置、不同类型细胞对药物响应的新方法，能完整再现药物对组织中不同位置、不同类型细胞在不同时刻的影响，是药效评估的理想工具。

13、本发明还提供上述用于活体组织和类器官药效评估的荧光微针的制备方法，包括以下步骤：

14、步骤一，合成荧光纳米颗粒

15、将荧光探针负载在纳米颗粒上得到荧光纳米颗粒。荧光纳米颗粒中也可以同时负载参比荧光染料。

16、步骤二，在微针模具尖端富集荧光纳米颗粒

17、将荧光纳米颗粒悬浮在分散液中得混合液体，纳米颗粒浓度在0.01-100 mg/l。然后将混合液体加入微针模具后进行离心，使所述荧光纳米颗粒经离心富集至微针模具底部的尖端空腔中，除去微针模具中上清液。除去上清液的方法可以通过吸取和/或干燥进行。

18、其中，所述尖端空腔的内直径为0.5-40 μm；所述荧光纳米颗粒的加入量为：所述荧光纳米颗粒干燥后所述荧光纳米颗粒在所述微针模具底部的尖端空腔的高度保持在0.5-20 μm。

19、离心条件可选择为离心力在1000~25000 g，离心时间在1~60 min。

20、步骤三，荧光微针成形

21、向所述微针模具中填充微针基质溶液，排除气泡，待溶剂挥发后脱模成形；其中，所述微针基质溶液所使用溶剂为能够溶解荧光纳米颗粒的溶剂；在所述溶剂作用下荧光纳米颗粒溶解，荧光探针（或荧光探针和参比荧光染料共同）在微针尖端重新分布，干燥后固定在所述代谢物响应区。

22、抽真空能够将微针基质溶液填充微针模具并排除气泡，作为举例，抽真空条件温度在5-50 ℃，真空度在0.05-0.5 mbar，时间在0.5-10分钟。

23、所述有机溶剂包括但不限于芳香烃类、卤代烃类、环醚类有机溶剂。作为举例，所述有机溶剂包括但不限于四氢呋喃、甲苯、氯仿中一种或多种的组合。在微针基质溶液的溶液作用下，荧光纳米颗粒溶解使得有机荧光染料在微针尖端位置重新分布，并固定在微针尖端，重新分布有利于微针尖端对代谢物进行快速响应。

24、本发明的上述制备荧光微针的方法，通过先合成能实时响应细胞内代谢物的荧光纳米颗粒，然后通过离心力成功将荧光纳米颗粒精准定位到微针模具的尖端直径为0.5-40μm、长度为0.5-20 μm的十分微小的检测区域，即代谢物响应区，再通过溶剂溶解，将荧光探针与微针尖端融合在一起，实现了荧光探针在细胞级别的定位和响应，最终实现在不破坏活体组织和类器官完整性的前提下对活体组织和类器官中不同位置、不同细胞类型对药物的响应的实时、原位测量，具有良好的时间和空间分辨率。

25、优选地，步骤一中所述负载的方式为物理包裹或共价连接；所述纳米颗粒为聚合物纳米颗粒或无机纳米颗粒。

26、优选地，所述荧光纳米颗粒的直径为25 nm-3000 nm。

27、优选地，微针基质的材料为聚苯乙烯及其衍生物、聚甲基丙烯酸异丁酯或水凝胶。

28、本发明的有益效果为：

29、本发明通过将荧光染料负载到纳米颗粒中合成荧光纳米颗粒，再通过离心使荧光纳米颗粒定位到微针模具的尖端空腔中，再注入微针基质溶液后通过溶剂将荧光纳米颗粒溶解使染料重新分布并固定在微针尖端区域中制成荧光微针。本发明的荧光微针上形成有尖端直径为0.5-40 μm、长度为0.5-20 μm的十分微小的代谢物响应区，仅能响应位于微针尖端附近的1-8个细胞中的代谢物，实现了荧光探针在微针尖端区域的精准定位，最终实现活体组织和类器官中细胞级别对药物的响应的实时、原位测量。由本发明的荧光微针制备的微针阵列具有良好的时间和空间分辨率。当将活体组织或类器官置于微针阵列上时，基于组织器官三维立体结构，在不同区域的微针可接触到不同深度、不同空间分区的细胞，从而在不破坏活体组织和类器官的情况下，直接测量活体组织和类器官不同位置细胞的代谢活性及对药物的响应。由于所采用的荧光纳米探针对待测的代谢物具有完全可逆且高灵敏度的响应性，以及快速响应代谢物浓度变化的能力，该微针阵列可以获得活体组织和类器官中不同位置、不同类型细胞在不同时刻的代谢活性和对药物的响应情况。这种具有时空分辨能力、并且在不破坏活体组织和类器官完整性情况下获得组织/器官中不同类型、不同位置细胞对药物响应的新方法，能完整再现药物对组织中不同位置、不同类型细胞在不同时刻的影响，是药效评估的理想工具。