一种酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法与流程

本发明涉及植物抗逆性鉴定与评价，具体地说是一种酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法。

背景技术：

1、随着工业化、城市化和农业集约化进程的加快，农田生态系统中重金属污染与酸沉降共同作用的问题日益突出。镉（cd）是一种典型有毒重金属，主要来源于采矿、冶炼、电镀、电池制造及磷肥施用等过程，具有毒性高、迁移性强、易在土壤中累积并被植物吸收等特点。酸雨主要由二氧化硫和氮氧化物排放后形成，可造成降水酸化和土壤酸化，改变土壤理化性质及植物根际环境。在低ph条件下，镉更容易由不易迁移形态转化为植物可吸收利用形态，从而增强其生物有效性和毒害作用，形成更复杂的复合胁迫影响。

2、鹰嘴豆作为豆科作物，在新疆等地具有一定种植基础和资源优势，其兼具食用价值和药用开发价值。新疆鹰嘴豆幼苗期对外界环境变化较为敏感，其株高、根长、生物量、根系构型、光合能力、抗氧化系统及镉积累等指标，均可反映植株对胁迫环境的响应程度。镉胁迫可抑制根系伸长和地上部生长，降低光合效率，干扰营养元素吸收，并诱导活性氧积累，造成膜脂过氧化和细胞膜损伤。

3、目前，植物耐受性评价多针对单一重金属胁迫、单一酸雨胁迫或少数生理生化指标，难以全面反映酸雨-镉复合胁迫下作物生长、生理、离子稳态和重金属积累之间的综合变化。尤其针对新疆鹰嘴豆幼苗，尚缺少一套处理体系明确、检测指标完整、评价结果可量化的耐受性评价方法。

4、基于上述陈述，本发明提供了一种酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术中针对新疆鹰嘴豆幼苗在酸雨与镉复合胁迫条件下耐受性评价体系不完善、评价指标单一、处理条件不明确，难以综合量化反映其生长、生理、根系构型、镉积累及营养离子变化的问题，本发明提供了一种酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法。

2、第一方面，本发明提供一种酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法，采用如下的技术方案：

3、一种酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法，包括以下步骤：

4、s1、选取新疆鹰嘴豆种子，经消毒、清洗、催芽和育苗处理，得到新疆鹰嘴豆幼苗；

5、s2、构建酸雨-镉复合胁迫处理体系，所述酸雨-镉复合胁迫处理体系包括镉浓度梯度和模拟酸雨ph梯度；

6、s3、将新疆鹰嘴豆幼苗置于水培系统中，进行酸雨-镉复合胁迫处理；

7、s4、在酸雨-镉复合胁迫处理后采集新疆鹰嘴豆幼苗样品，检测与耐受性评价相关的指标组合，所述指标组合包括：

8、元素含量指标：cd、ca、k、mg和fe；

9、抗氧化系统指标：sod、pod、cat、apx和gsh；

10、氧化胁迫与膜损伤指标：h2o2、mda、o2-.和相对电导率；

11、根系构型指标：根总长、根表面积、根尖数和根体积；

12、生长形态指标：根干重、茎干重、叶干重、根冠比、株高和根长；

13、s5、对各项指标进行标准化处理，计算综合耐受性指数，根据综合耐受性指数评价新疆鹰嘴豆幼苗在酸雨-镉复合胁迫下的耐受性。

14、优选的，所述步骤s1中消毒为采用8-10wt%的h2o2溶液消毒10-20min；所述清洗为用无菌蒸馏水冲洗2-3遍；所述催芽为在22-28℃恒温箱中黑暗催芽2-3天。

15、优选的，所述步骤s1中育苗具体为：将催芽后的新疆鹰嘴豆种子播种于装有灭菌石英砂的育苗容器中，采用1/4浓度hoagland营养液进行培养，培养温度为22-28℃，光照周期为14-16h光照/8-10h黑暗，光照强度为300-500μmol·m-2·s-1，相对湿度为60-70%，培养时间为7-10天。

16、优选的，所述步骤s2中镉浓度梯度为cdcl2浓度0μm、5μm和20μm；所述模拟酸雨ph梯度为ph5.6、ph4.5和ph3.0；所述模拟酸雨为硫酸-硝酸型酸雨，其中h2so4与hno3的摩尔比为5-8：4。

17、优选的，所述步骤s2中酸雨-镉复合胁迫处理体系包括9个处理组合，分别为：cd0+ph5.6、cd5+ph5.6、cd20+ph5.6、cd0+ph4.5、cd5+ph4.5、cd20+ph4.5、cd0+ph3.0、cd5+ph3.0和cd20+ph3.0。

18、优选的，所述步骤s2中酸雨-镉复合胁迫处理体系的每个处理组合设置3-5个生物学重复，每个生物学重复包括5-10株新疆鹰嘴豆幼苗，各处理组合随机排列培养。

19、优选的，所述步骤s3中水培系统为：将新疆鹰嘴豆幼苗移入1/2浓度hoagland营养液中预培养24-48h后，更换为含设定浓度cdcl2的1/2浓度hoagland营养液，并采用模拟酸雨调节营养液ph至对应ph梯度值；处理期间通气培养，每2-3d更换一次营养液，更换后重新加入cdcl2至设定浓度并采用模拟酸雨调节ph至对应ph梯度值，处理时间为7-14d。

20、优选的，所述步骤s4中采集新疆鹰嘴豆幼苗样品时，将根、茎和/或叶分离，根系先用无菌蒸馏水冲洗2-3遍，再采用10-20mmol/l的edta-na2溶液浸洗5-10min以去除根表吸附镉，随后用无菌蒸馏水冲洗2-3遍。

21、优选的，所述步骤s4中元素含量指标的检测为：将根、茎和/或叶干燥和粉碎后，经硝酸-高氯酸消解，采用原子吸收分光光度法测定cd、ca、k、mg和fe含量。

22、优选的，所述步骤s4中抗氧化系统指标、氧化胁迫与膜损伤指标、根系构型指标和生长形态指标的检测具体包括：

23、采用紫外分光光度法测定sod、pod、cat和apx活性；

24、采用dtnb比色法测定gsh含量；

25、采用硫酸钛比色法测定h2o2含量；

26、采用羟胺氧化法测定o2-.含量；

27、采用硫代巴比妥酸法测定mda含量；

28、采用电导率仪测定相对电导率；

29、采用根系扫描仪测定根总长、根表面积、根尖数和根体积；

30、采用直尺测定株高和根长，并将根、茎、叶烘干至恒重后测定根干重、茎干重和叶干重，计算根冠比。

31、优选的，所述步骤s5中综合耐受性指数的计算方法包括：

32、将ca、k、mg、fe、sod、pod、cat、apx、gsh、根总长、根表面积、根尖数、根体积、根干重、茎干重、叶干重、根冠比、株高和根长作为正向指标，将cd、h2o2、mda、o2-.和相对电导率作为负向指标；

33、分别对所述正向指标和负向指标进行标准化处理，得到标准化后的指标值uij；

34、以标准化后的指标值uij为输入进行主成分分析，确定各指标的权重wi；

35、根据标准化后的指标值uij和各指标的权重wi计算第j个评价对象的综合耐受性指数dj，根据综合耐受性指数dj的大小对耐受性进行排序，dj值越大，判定其耐受性越强。

36、优选的，所述步骤s5中综合耐受性指数的计算方法具体包括：

37、将ca、k、mg、fe、sod、pod、cat、apx、gsh、根总长、根表面积、根尖数、根体积、根干重、茎干重、叶干重、根冠比、株高和根长作为正向指标，将cd、h2o2、mda、o2-.和相对电导率作为负向指标；

38、对正向指标按照公式：进行标准化处理；

39、对负向指标按照公式：进行标准化处理；

40、其中，xij为第j个评价对象中第i项指标的实测值，xi,max和xi,min分别为第i项指标在所有评价对象中的实测值中的最大值和最小值；uij为标准化后的第j个评价对象中第i项指标值；

41、采用主成分分析确定各指标权重wi，具体为：以标准化后的指标值uij为输入进行主成分分析，选取累计方差贡献率≥85%的前p个主成分；记第k个主成分的方差贡献率为αk，第i项指标在第k个主成分上的因子载荷为lik，按照公式：，计算第i项指标的综合贡献值bi；并按照公式：，对各指标综合贡献值进行归一化，得到第i项指标的权重wi；其中，m为指标总数，p为所选取的主成分数量；

42、再按照公式：，计算第j个评价对象的综合耐受性指数dj，根据综合耐受性指数dj的大小对耐受性进行排序，dj值越大，判定其耐受性越强。

43、优选的，当某一指标的xi,max等于xi,min时，将该指标作为无区分度指标从综合耐受性指数计算中剔除。

44、优选的，本发明中评价对象是指待评价的新疆鹰嘴豆材料（如不同地方品种、品系）和/或不同酸雨-镉复合胁迫处理组合。在实际应用中，评价对象可根据评价目的灵活确定，例如为比较不同品种的耐受性时，评价对象为各品种在同一处理下的测定数据；为比较不同处理强度的影响时，评价对象为同一品种在各处理下的测定数据。

45、第二方面，本发明提供了一种上述的酸雨-镉复合胁迫下新疆鹰嘴豆幼苗耐受性评价方法在筛选耐酸雨-镉复合胁迫新疆鹰嘴豆种质中的应用。

46、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

47、（1）本发明构建了包括镉浓度梯度和模拟酸雨ph梯度的酸雨-镉复合胁迫处理体系，并进一步限定了水培系统的处理方式、处理时间、营养液更换以及重复设置方式，使新疆鹰嘴豆幼苗在酸雨与镉复合胁迫条件下的处理条件更加明确，有利于提高不同处理组合之间评价结果的可比性和重复性。

48、（2）本发明从元素含量、抗氧化系统、氧化胁迫与膜损伤、根系构型以及生长形态等多个方面选取评价指标，能够同时反映新疆鹰嘴豆幼苗在复合胁迫下的镉积累、营养离子变化、氧化损伤程度、抗氧化防御能力、根系发育状况及植株生长表现，相较于单一生长指标或单一生理指标评价方式，该评价内容更加全面。

49、（3）本发明将正向指标和负向指标分别进行标准化处理，并采用主成分分析确定各指标权重，再计算综合耐受性指数，能够降低不同量纲指标之间的影响，并减少人工赋权带来的主观性，有利于对新疆鹰嘴豆幼苗在酸雨-镉复合胁迫下的耐受性进行综合量化评价。

50、（4）本发明在样品采集过程中对根系进行清洗和edta-na2溶液浸洗处理，以去除根表吸附镉，有助于降低根表外源吸附镉对元素含量测定结果的干扰，使镉积累及相关元素含量的检测结果更能反映植株组织内部的实际情况。

51、（5）本发明设置水培系统进行复合胁迫处理，便于控制营养液中镉浓度和ph条件，降低基质差异对处理效果的影响，从而提高评价方法的可控性和重复性。

52、（6）本发明通过综合耐受性指数对新疆鹰嘴豆材料的耐受性进行排序，能够为耐酸雨-镉复合胁迫新疆鹰嘴豆种质的筛选提供量化依据，也可以为后续研究新疆鹰嘴豆对酸雨和镉复合胁迫的响应机制及种质资源利用提供参考。