一种基于β-谷甾醇含量监测灵芝助眠效果的方法及其应用

本发明涉及生物医药及保健食品，具体涉及一种基于内源β-谷甾醇定量监测灵芝光应激失眠专属助眠效果的方法及其应用，尤其适用于靶向gabra1、改善光应激焦虑型失眠的灵芝监测评价与质控。

背景技术：

1、现代社会生活节奏加快、电子设备广泛普及导致的夜间光暴露、精神压力激增、作息不规律等多重因素，大幅推高失眠人群占比，长期失眠会增加多种躯体及精神疾病的患病风险。现阶段围绕灵芝改善睡眠的相关研究可分为三大类：第一类以灵芝多糖为活性物质开展助眠探究，刘春芳等以灵芝多糖提取物与γ-氨基丁酸为核心原料得到片剂处方，发现可显著延长睡眠时间，具备改善睡眠的保健功效，李炜等阐明灵芝腺苷能够依托a2a受体调控睡眠觉醒周期，这些研究均以水溶性组分为核心研究对象，未关注脂溶性物质；第二类以灵芝三萜组分作为研究对象，俞盈等以粗提灵芝三萜酸开展小鼠睡眠药理实验，证实三萜酸可协同巴比妥类药物缩短入睡潜伏期、延长睡眠时长，但仅明确三萜大类有效，未区分单体作用；第三类采用不同极性灵芝提取物开展斑马鱼失眠模型恢复对比，何荣军等比较灵芝水提物、乙醇提取物和乙酸乙酯提取物的助眠差异，证实醇溶性组分助眠活性更优；白肉灵芝相关网络药理学研究推测灵芝甾醇类成分可能是潜在活性靶点物质，但仅未进行试验验证，缺少动物模型生物学数据支撑这一结论。

2、灵芝甾醇是灵芝重要的特征性次生代谢活性成分，与灵芝多糖、灵芝三萜共同构成灵芝三大核心药效物质基础，主要包含麦角甾醇、过氧化麦角甾醇、灵芝醇、麦角甾烯醇等二十余种单体组分。现有药理学研究已证实灵芝甾醇类成分具有抗炎、抗氧化、神经保护、免疫调节等多重生物活性，是灵芝发挥安神镇静、调节神经功能、改善睡眠紊乱的重要物质基础之一，明确证明甾醇类组分参与灵芝中枢神经调节与睡眠调控过程，具备改善睡眠的药理潜力。

3、目前针对灵芝甾醇的研究仍存在明显方向偏向性与技术空白，尚未形成针对助眠药效的精准质控体系。现有公开研究多集中于灵芝甾醇的成分分离鉴定、提取工艺优化、抗氧化、抗肿瘤及神经退行性疾病保护等广谱活性探究。单一成分方面，研究重心长期聚焦麦角甾醇的含量检测、稳定性影响因素及体外活性验证。

4、综上所述，现有技术仍未能解决以下问题：第一，现有研究未明确β-谷甾醇与灵芝特异性助眠效果的量效对应关系，未界定有效含量阈值，尚未证实内源β-谷甾醇稳态含量直接决定灵芝提取物靶向改善光应激失眠的药效强弱；第二，现有甾醇检测技术多针对孢子粉、孢子油中麦角甾醇开发，仅实现单一成分定量检测，未绑定具体失眠适应症与核心靶点活性，无法实现“特征成分含量-靶点激活能力-专属助眠药效”的精准对应；第三，行业传统灵芝助眠质控体系长期依赖总三萜、总多糖等宏观总量指标，未将甾醇类特征单体作为细分精准助眠药效的专属质控标志物，导致灵芝甾醇专属助眠价值无法在产品质量监测评价中落地应用。

5、针对以上问题，为加快开发灵芝助眠产品，本发明开拓性建立一种β-谷甾醇阈值绑定gabra1靶向光应激失眠效果的监测体系，这种新的方法专属效果明显，突破行业仅靠总三萜、总多糖宽泛质控的固有模式。

技术实现思路

1、发明目的：为更精确开发灵芝助眠产品，本发明提供了一种基于β-谷甾醇含量监测灵芝助眠效果的方法及其应用，替代传统周期长、成本高的动物药效验证方法，实现灵芝特异性助眠作用的快速、精准监测评价。

2、技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案具体如下。

3、1. 灵芝脂溶性醇提物制备。针对灵芝子实体中β-谷甾醇特点，进行脂溶性醇提物制备。取适量灵芝子实体，进行粉碎，加入20倍量（g/ml）的无水乙醇，充分搅匀后密封浸泡30-60 min，于80-90 ℃下加热回流提取3-5 h。回流提取结束后冷却至室温，收集滤液，将滤液于减压条件下浓缩，所得浓缩液经冷冻干燥，得灵芝醇提物冻干粉末，于干燥条件下密封保存备用，待测。

4、2.快速检测方法。采用高效液相色谱法，对醇提物中β-谷甾醇的含量进行测定。具体步骤如下：精密称取β-谷甾醇标准品10 mg，加入甲醇适量，超声溶解后置于室温自然冷却，再加甲醇准确定容至10 ml，即可得到浓度为1mg/ml的标准储备液，将其浓度进行稀释，得50、100、300、500 μg/ml，0.45 μm滤膜过滤，待测；将冷冻干燥得到的样品粉末以甲醇溶解，使最终浓度为10 mg/ml，0.45 μm滤膜过滤，待测。hplc条件为，色谱柱：agilenteclipse xdn-c18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（97∶3）；流速：1 ml/min；柱温：35℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μl。以β-谷甾醇标准品为对照，定性定量分析灵芝醇提物中β-谷甾醇含量。

5、3.核心质控阈值创新：首次验证并界定灵芝脂溶性醇提物中含β-谷甾醇≥7.0mg/g是灵芝子实体具备gabra1靶向活性、可改善光应激失眠的有效判断值，高于该阈值则具有光应激焦虑型失眠特异性助眠效果，有效区分灵芝原料的质量及应用方向。

6、3.1造模及实验分组：随机选取5 dpf发育正常的斑马鱼幼鱼，随机分配至六孔板中，每孔10尾，温度保持在28 ± 0.5 ℃。蓝光强光暴露诱导对斑马鱼进行造模。具体分组及处理方式见图1。

7、3.2斑马鱼行为采集及分析：给药结束后，将斑马鱼幼鱼转移至注有养鱼水的六孔板中（每孔1尾），于28±0.5 ℃恒温环境中连续录制60 min行为视频，录制期间采取遮光及隔音措施以隔绝外界干扰。采用deeplabcut无标记运动追踪工具，以鱼体中心点为追踪目标逐帧输出平面坐标数据，对置信度低于0.95、越界及异常跳动的坐标点借助插值法进行校正与补全；剔除前50 s适应期数据后，依据单孔实际直径（3.5 cm）完成像素-物理距离标定换算，以孔中心为原点、孔径半径的0.5倍划定中央区，其余为周边区，统计总运动距离、平均游动速率、静止与运动时长占比及中央区探索指标，量化斑马鱼运动活力与空间探索偏好。

8、3.3斑马鱼游动轨迹图与量化行为指标结果见图2。上述行为学特征提示，失眠模型斑马鱼存在中枢神经过度兴奋、焦虑水平升高及对开阔区域的回避倾向。β-谷甾醇和灵芝醇提物在行为学层面能够有效缓解失眠斑马鱼的神经兴奋与焦虑状态，改善其异常运动行为。

9、3.4qpcr检测药物对斑马鱼

gabra1基因表达量的影响：每组取90尾斑马鱼，设置3个平行，按照总rna柱式提取试剂盒说明书步骤提取样本的rna。rna提取完成后，使用超微量分光光度计测定rna浓度。用pcr扩增仪将测定过浓度的rna逆转录成cdna于-20°c保存待用。在qpcr管中配置2×taq pro universal sybr qpcr master mix、10 μm primer、cdna、ddh2o混合液，经历95 °c、30 s的预变性一个循环，95 °c、10 s，60 °c、30 s的循环反应40个循环，60°c、15 s，60°c、60 s，95°c、15 s的融解曲线一个循环。记录ct值，根据2-△△ct计算目标基因mrna的相对表达量。内参基因为

gapdh。引物通过ncbi设计，生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表1所示。

10、表1 引物序列

11、

12、不同浓度β-谷甾醇均能逆转造模所诱导的

gabra1基因抑制（图3a）。灵芝醇提物分子定量结果与行为学观察结论相互印证，并对灵芝醇提物中的β-谷甾醇等效浓度6 μg/ml进行同步实验，灵芝醇提物干预后可显著上调该基因表达。因此，推测灵芝醇提物可能通过其活性成分β-谷甾醇作用于

gabra1基因，进而调控gaba能突触通路，纠正斑马鱼异常游动行为，最终发挥改善睡眠的作用。

13、3.5elisa测定药物对斑马鱼gabra1蛋白分泌水平的影响：斑马鱼分组后造模、给药各24 h，在每组中各选取90尾斑马鱼，将其均分为3个平行样本。用滤纸小心吸干斑马鱼表面水分后，准确称取斑马鱼组织的重量。按照重量（g）与体积（ml）为1:9的比例，向斑马鱼样本中加入9倍体积的磷酸盐缓冲液。在冰水浴环境下，使用高速研磨机对样本进行匀浆处理，以确保组织充分破碎。匀浆结束后，将样本进行充分离心操作，随后收集上清液，-80 ℃保存备用，按照相应elisa试剂盒说明书操作步骤，测定各样本中gabra1蛋白的含量。

14、elisa蛋白定量结果与qpcr基因检测趋势保持一致（图4）。在β-谷甾醇不同浓度梯度实验中，各给药组均能逆转造模所诱导的gabra1蛋白表达抑制（图4a）。在斑马鱼失眠模型中，造模处理显著下调了组织内gabra1蛋白分泌水平，而灵芝醇提物干预后可显著上调该蛋白表达，但提升效果弱于同等当量β-谷甾醇纯品干预组，推测灵芝醇提物可能通过其活性成分β-谷甾醇上调gabra1蛋白表达，进而调控gaba能突触通路，纠正斑马鱼失眠状态下的神经递质受体异常，最终发挥改善睡眠的作用。

15、3.6网络药理学分析以及分子对接验证：

16、3.6.1 数据库与在线平台 本研究网络药理学分析所涉及的主要数据库及在线平台信息见表1。中药活性成分及其相关靶点数据通过tcmsp数据库（traditional chinesemedicine systems pharmacology database）获取；化合物基础理化参数查询自pubchem数据库；化合物潜在作用靶点通过swisstargetprediction平台预测；失眠症相关疾病靶点分别从omim、ttd、genecards、pharmgkb、drugbank、clinpgx及ncbi数据库检索收集；靶点蛋白名称的标准化转换借助uniprot数据库完成；蛋白-蛋白相互作用（ppi）网络构建依托string数据库；受体蛋白三维结构从pdb数据库获取。

17、3.6.2 灵芝活性成分筛选与靶点预测 借助tcmsp数据库检索灵芝的化学成分信息，并以口服生物利用度（oral bioavailability，ob）≥30%和类药性（drug-likeness，dl）≥0.18为阈值，筛选灵芝的主要活性成分及其对应作用靶点。

18、3.6.3 失眠症疾病靶点的收集与整合 以“insomnia”为检索关键词，分别在omim、drugbank、genecards、pharmgkb及ttd 5个数据库中搜索失眠症相关靶点。将各数据库所得靶点合并后取并集，获得失眠症疾病靶点集合。

19、3.6.4 灵芝-失眠交集靶点的获取 通过rstudio编程将2.2.2节所得灵芝活性成分作用靶点与2.2.3节所得失眠症疾病靶点进行韦恩图分析，取两者交集，即为灵芝干预失眠症的潜在作用靶点。

20、3.6.5 蛋白-蛋白互作网络构建与核心靶基因筛选 将上述潜在作用靶点导入string数据库，物种限定为智人（homo sapiens），设置中等置信度阈值（交互评分≥0.400）构建ppi网络，以确保节点间相互作用的可靠性，并剔除游离于主网络之外的孤立节点。

21、将ppi网络数据导入cytoscape 3.9.1软件，利用cytonca插件进行网络拓扑参数分析。分别计算各节点的介度中心性（betweenness centrality，bc）、紧密中心性（closeness centrality，cc）、度中心性（degree centrality，dc）、特征向量中心性（eigenvector centrality，ec）、局部平均连通性（local average connectivity，lac）及网络中心性（network centrality，nc）6项指标。以各项指标中位数为截断值进行初步筛选，对所得节点重复上述筛选过程两次，最终获得灵芝干预失眠症的核心靶基因。

22、3.6.6 go功能富集与kegg通路富集分析 将2.2.4节所得交集靶基因文件，经uniprot数据库完成基因id标准化转换后，借助r语言及相关生物信息学包进行基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析。go功能富集涵盖生物过程（biological process，bp）、细胞组分（cellular component，cc）和分子功能（molecularfunction，mf）3个维度。分别选取go富集结果中显著性最高的前10个条目及kegg通路富集结果中显著性最高的前30条通路进行可视化展示。

23、3.6.7 核心靶点的分子对接验证

24、 从pubchem数据库下载主要活性成分的分子结构文件（sdf格式），从pdb数据库获取核心靶点蛋白的三维晶体结构。使用pymol软件对蛋白结构进行预处理，去除水分子及原始配体后保存为pdb格式，并借助getbox plugin插件获取对接口袋参数。将处理后的蛋白及活性成分文件导入autodock tools 1.5.6，转换为pdbqt格式，采用autodock vina1.5.6执行分子对接计算。对接结果通过pymol 2.6.0软件进行可视化展示与分析。

25、3.6.8 网络药理学分析以及分子对接验证结果如下：

26、（1）灵芝潜在作用靶点预测结果

27、经tcmsp数据库检索及adme参数筛选，共获得灵芝活性成分40个及其对应作用靶点。以“insomnia”为关键词，在疾病数据库中检索并整合去重，共收集失眠症相关疾病靶点557个。将上述活性成分作用靶点与疾病靶点进行交集分析，经韦恩图可视化与统计分析，共获得交集靶点22个（图5），即为灵芝干预失眠症的潜在作用靶点。

28、（2） 潜在作用靶点的go功能和kegg通路富集分析

29、采用uniprot数据库对灵芝与睡眠疾病的潜在作用靶点进行go和kegg通路富集分析。

30、go功能富集分析结果（图6）显示，灵芝对失眠症的潜在作用靶点主要涉及以下三个层面：在生物过程方面，主要富集于膜电位调节、g蛋白偶联受体信号通路、磷脂酶c激活的g蛋白偶联受体信号通路、乙酰胆碱受体信号通路、腺苷酸环化酶调节的g蛋白偶联受体信号通路、细胞对乙酰胆碱的反应、突触后信号转导及突触后膜电位调节等条目；在细胞组分方面，主要分布于突触后膜、突触膜、gabaa受体复合体、gaba受体复合体、树突膜、gaba能突触、氯离子通道复合体、突触后特化膜、神经元突起膜及突触前膜等结构；在分子功能方面，主要涉及神经递质受体活性、突触后神经递质受体活性、g蛋白偶联胺受体活性、乙酰胆碱受体活性、苯二氮䓬受体活性、gaba门控氯离子通道活性、神经递质门控单原子离子通道活性、gabaa受体活性及参与突触后膜电位调节的神经递质受体活性等条目。

31、kegg通路富集分析结果（图7）共富集到多条信号通路，选取显著性排名前20的通路进行可视化展示。这些通路主要包括：神经活性配体-受体相互作用、神经活性配体信号传导、钙信号通路、吗啡成瘾、胆碱能突触、尼古丁成瘾、味觉转导、逆行内源性大麻素信号传导、激素信号传导、神经退行性病变-多种疾病通路、gaba能突触、唾液分泌、5-羟色胺能突触、心肌细胞肾上腺素能信号传导、camp信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控、阿尔茨海默病、钙黏蛋白信号传导、脂肪细胞脂解调控、cgmp-pkg信号通路、化学致癌-受体激活、花生四烯酸代谢、缝隙连接及小细胞肺癌等。

32、（3） 潜在作用靶点的蛋白互作网络构建与分析

33、将从韦恩图中提取的相交靶标导入string数据库，以构建ppi网络。将结果以tsv文件格式导出并导入cytoscape3.10.3进行拓扑分析，见表2和图8a。通过2次筛选后，首次筛选得到8个核心靶点（图8b）。第二次筛选进一步缩小范围，最终确定3个关键作用靶点，分别为gabra1、gabra2和htr2a（图8c）。

34、gabra1，γ-氨基丁酸a型受体α1亚基，是gabaa受体的主要亚基之一，在中枢神经系统中广泛表达，介导抑制性神经递质gaba的快速突触传递，在调节神经元兴奋性和维持睡眠-觉醒周期中发挥关键作用。gabra2，γ-氨基丁酸a型受体α2亚基，同样属于gabaa受体家族，主要分布于突触外区域，介导紧张性抑制电流，参与焦虑调节和睡眠稳态的维持。htr2a，5-羟色胺2a受体，是5-羟色胺受体家族的重要成员，广泛分布于大脑皮层和边缘系统，参与调节觉醒、情绪认知和快速眼动睡眠的调控。

35、表2 关键作用靶点的拓扑学分析结果

36、

37、（4） gabra1靶点与通路间的关键作用分析

38、将最终的3个靶点导入ncbi数据库搜索，仅有gabra1与斑马鱼体系相关，将其与kegg通路富集分析进行结合分析可知，gabra1作用于gaba能突触通路（gabaergicsynapse），通过靶向调控gabaa受体来发挥作用（图9a、b）。

39、（5） 分子对接模型分析

40、将gabra1靶点与韦恩图中筛选所得的灵芝活性成分进行分子对接分析，如图10结果显示，灵芝来源的活性成分β-谷甾醇可与gabra1靶点形成稳定的复合物结合模式。具体而言，β-谷甾醇能够精准嵌入由β-折叠和无规则卷曲共同构成的靶蛋白活性结合口袋内，通过氢键作用与口袋内关键氨基酸残基相结合，从而定位于该蛋白的配体结合功能域；同时，其与周围氨基酸残基之间形成的疏水相互作用进一步稳定了复合物的结合构象。该结果从结构生物学层面证实了β-谷甾醇与gabra1具有直接结合能力。

41、综合网络药理学预测与分子对接结果，推测灵芝活性成分β-谷甾醇可能直接结合核心靶点gabra1，并通过调控gaba能突触通路发挥潜在助眠作用。由于

gabra1为斑马鱼基因组中存在的同源基因，后续实验采用斑马鱼失眠模型开展体内功能验证，分别从蛋白表达及基因转录水平系统探究β-谷甾醇经由gabra1靶点改善失眠的作用机制，以期为灵芝助眠功效提供体内实验层面的证据支撑。

42、通过以上网络药理学挖掘灵芝干预失眠的潜在靶点，经ppi网络筛选锁定核心靶基因

gabra1，拓扑分析明确β-谷甾醇为灵芝调控失眠模型的关键活性物质之一，通路富集结果提示gaba能突触为其核心调控通路，而分子对接结果从结构生物学层面初步验证确定了β-谷甾醇与gabra1靶点之间的直接相互作用。这些结果为建立基于内源β-谷甾醇阈值的gabra1靶向、光应激专属效果监测方法提供坚实的依据。

43、多场景创新性应用：本技术可应用于以下领域：（1）灵芝原料精准筛选分级与优品优用；（2）光应激精准助眠专属产品定向开发；（3）功能性灵芝产品货架期效果动态预警。

44、本发明有益效果

45、1. 首创差异化质控体系，创造性充足：突破行业灵芝总三萜、总多糖宽泛质控的固有模式，首次建立基于内源β-谷甾醇阈值的gabra1靶向、光应激专属效果监测方法，解决传统质控无特异性、无量化标准的行业痛点，无现有技术启示，彻底规避灵芝助眠同质化缺陷；

46、2. 检测高效、成本低廉、适配产业化：替代传统动物模型效果验证，检测周期短、操作简便、重复性好，可实现原料入库、生产批次、成品出库的全流程快速质控，大幅降低产品质检成本；

47、3. 精准区分效果类型，产品差异化显著：可精准区分灵芝提取物广谱安神活性与光应激失眠特异性干预活性，为高端精准助眠灵芝产品提供核心技术壁垒，区别于市面所有通用型灵芝安神产品。