一种基于糖尿病肾病进展风险评估的试剂盒

本发明属于体外诊断试剂，具体的说是一种基于糖尿病肾病进展风险评估的试剂盒。

背景技术：

1、糖尿病肾病（diabetic nephropathy, dn/dkd）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是终末期肾病（esrd）的主要致病因素。国际糖尿病联盟（idf）最新数据显示，全球约有5.37亿成年人患有糖尿病，预计到2045年将增至7.83亿。其中，由2型糖尿病引起的慢性肾脏病发病率在过去20年中全球增长了74%，超过1.47亿患者来自中国。dkd的发病具有隐匿性，早期诊断困难，数十年漫长的治疗过程给患者带来巨大的经济负担，最终导致生活质量严重下降，并成为终末期肾病的主要原因。

2、目前，临床上dkd的早期筛查和进展评估主要依赖尿微量白蛋白（malb）检测和估算肾小球滤过率（egfr）。然而，尿微量白蛋白检测存在以下不足：（1）灵敏度有限：部分dkd患者在出现显著蛋白尿之前已经发生肾小管间质损伤，但malb检测仍为阴性，导致漏诊；（2）特异性不足：运动、感染、发热等多种非肾脏因素均可引起一过性蛋白尿升高，造成假阳性；（3）检出时间滞后：malb升高通常意味着肾小球滤过屏障已发生结构性损伤，错过了最佳干预窗口期。肾穿刺活检虽为金标准，但因其侵入性、风险性和不可重复性而难以作为常规筛查手段。

3、针对上述问题，现有技术中已有一些改进方案。

4、中国专利cn114657252a公开了一种基于尿液外泌体mirna的糖尿病肾病早期诊断试剂盒。该专利采用检测尿液外泌体中mir-21、mir-192和mir-29a的表达水平来判断dkd风险。然而，该方法存在以下缺陷：一方面，单一mirna指标在不同人群中表达波动较大，仅检测三种mirna的组合难以全面反映dkd复杂的病理生理过程；另一方面，该专利未涉及蛋白层面检测，无法直接反映功能性蛋白分子在疾病进展中的实际变化，缺乏蛋白层面的验证信息。

5、中国专利cn113981072a公开了一种用于糖尿病肾病诊断的尿液外泌体蛋白标志物组合及其应用，该专利通过检测尿液外泌体中α1-微球蛋白和转铁蛋白来评估dkd。然而，该方法的缺陷在于：所选择的α1-微球蛋白和转铁蛋白均为反映肾小球滤过功能损伤的通用蛋白标志物，并非dkd特异性的致病分子靶标；这导致在合并其他肾小球疾病时（如高血压肾病、iga肾病等）特异性不足，难以实现dkd的精准鉴别诊断。

6、中国专利cn115902235a公开了一种基于多种尿液蛋白标志物的糖尿病肾病诊断模型，通过检测尿液中ngal、kim-1、il-18等肾小管损伤标志物构建诊断模型。该专利的缺陷在于：采用的ngal、kim-1等均为急性肾损伤（aki）的经典标志物，虽然在dkd中也有一定程度升高，但这几个标志物在泌尿系统感染、药物性肾损伤等多种急性状态下均可显著升高，无法有效区分dkd的慢性进展性损伤与其他类型的急性肾损伤，导致对dkd进展风险评估的特异性不足。

7、此外，在基础研究层面，已有文献报道txnip在糖尿病及dkd中的重要致病作用。硫氧还蛋白相互作用蛋白（txnip）是体内唯一已知的内源性硫氧还蛋白（trx）结合抑制蛋白，在糖尿病状态下表达显著上调，能够通过抑制trx活性导致氧化应激、胰岛β细胞凋亡和增殖抑制（曹竹杰等，生理学报，2018）。进一步研究发现，血管紧张素ii（ang ii）可通过其1型受体（at1r）上调txnip的表达，提示txnip参与肾素-血管紧张素系统（ras）介导的肾脏损伤过程（冯艳金等，生理学报，2018）。最新的多组学整合分析表明，在dkd进展过程中，tnfsf9上调与ddit4l下调分别代表了炎症信号激活与代谢调控异常两个重要的分子特征，二者共同参与高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤（liu等，2026，博士论文）。然而，现有技术均未将上述致病分子标志物--尤其是txnip蛋白、txnip mrna的m6a甲基化修饰、tnfsf9和ddit4l的组合--转化为可用于dkd进展风险评估的临床检测产品。

8、综上，现有技术在dkd进展风险评估领域共同存在以下核心问题：（1）检测靶标缺乏dkd致病特异性，采用的标志物多为通用性肾损伤指标而非dkd特异性致病分子；（2）检测维度单一，未将蛋白表达水平与表观遗传修饰（如m6a甲基化）进行联合分析；（3）缺乏将dkd特异性致病分子标志物从基础研究转化为临床检测产品的可行方案。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明提出的一种基于糖尿病肾病进展风险评估的试剂盒。本发明主要用于解决在肾功能显著下降前实现早期预警，克服现有尿微量白蛋白检测灵敏度不足、检出时间滞后以及现有分子标志物检测特异性不足的问题。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供了一种基于糖尿病肾病进展风险评估的试剂盒，包括：尿液外泌体分离模块，用于从待测尿液样本中分离获得尿液细胞外囊泡（uevs），所述尿液外泌体分离模块包含超速离心柱和/或免疫磁珠，所述免疫磁珠表面偶联有抗cd63抗体和/或抗cd9抗体和/或抗cd81抗体；外泌体txnip蛋白检测模块，用于定量检测所述尿液细胞外囊泡中硫氧还蛋白相互作用蛋白（txnip）的蛋白丰度，所述外泌体txnip蛋白检测模块包含抗txnip捕获抗体包被的酶标板、生物素标记的抗txnip检测抗体以及链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物；外泌体txnip mrna的m6a甲基化水平检测模块，用于检测所述尿液细胞外囊泡中txnip mrna的n6-甲基腺苷（m6a）甲基化水平，所述外泌体txnip mrna的m6a甲基化水平检测模块包含抗m6a抗体包被的免疫捕获微球、txnip特异性引物对、逆转录酶以及实时荧光定量pcr反应预混液；（4）风险评估模型模块，用于将所述txnip蛋白丰度检测值、txnip mrna的m6a甲基化水平检测值输入预训练的风险评估模型，输出糖尿病肾病进展风险评分。

3、作为本发明的进一步改进，所述试剂盒还包括外泌体tnfsf9蛋白检测模块和外泌体ddit4l蛋白检测模块；所述外泌体tnfsf9蛋白检测模块包含抗tnfsf9捕获抗体包被的酶标板和生物素标记的抗tnfsf9检测抗体；所述外泌体ddit4l蛋白检测模块包含抗ddit4l捕获抗体包被的酶标板和生物素标记的抗ddit4l检测抗体；所述风险评估模型模块还将所述tnfsf9蛋白检测值和ddit4l蛋白检测值输入所述预训练的风险评估模型。通过引入tnfsf9和ddit4l作为辅助标志物，tnfsf9的上调反映jak1/stat5炎症信号激活程度，ddit4l的下调反映akt/mtor代谢应激异常程度，从而实现对dkd进展过程中炎症与代谢两个核心维度的同步评估，提高风险评估的全面性和准确性。

4、作为本发明的进一步改进，所述外泌体txnip mrna的m6a甲基化水平检测模块的检测流程为：将分离得到的尿液细胞外囊泡裂解后，使用抗m6a抗体包被的免疫捕获微球富集含m6a修饰的mrna片段；对富集的mrna进行逆转录获得cdna；使用所述txnip特异性引物对进行实时荧光定量pcr检测，获得txnip m6a甲基化信号ct值；以input组为参照，采用法计算txnip mrna的m6a甲基化相对水平。m6a甲基化是真核生物mrna上最常见的内部修饰，其水平变化能够反映基因表达的转录后调控状态，在蛋白质丰度变化之前即可检测到信号异常，因此可作为比蛋白水平更早期的预警指标。

5、作为本发明的进一步改进，所述txnip特异性引物对包括：上游引物序列为5'-agtgattggcaggaggtc-3'（seq id no:1），下游引物序列为5'-ggtgtctgggatgtttagg-3'（seq id no:2）。该引物对经实验验证具有良好的扩增特异性和效率，能够准确检测尿液外泌体中低丰度的txnip mrna。

6、作为本发明的进一步改进，所述预训练的风险评估模型为基于logistic回归的多变量风险评估模型，其风险评分计算公式为：risk score = β0 + β1 × x1 + β2 × x2 +β3 × x3 + β4 × x4，其中x1为txnip蛋白丰度检测值、x2为txnip mrna的m6a甲基化水平检测值、x3为tnfsf9蛋白检测值、x4为ddit4l蛋白检测值，β0为截距项，β1~β4为各标志物的权重系数。所述权重系数通过临床队列样本训练获得，基于受试者工作特征曲线（roc）的曲线下面积（auc）≥0.85。

7、作为本发明的进一步改进，所述试剂盒还包括尿液吲哚-3-丙酸（ipa）检测模块，所述尿液ipa检测模块包含ipa标准品、液相色谱-质谱联用流动相试剂以及同位素内标；所述风险评估模型模块还将所述ipa检测值输入所述预训练的风险评估模型。ipa作为肠道菌群色氨酸代谢产物，在dkd患者中水平显著下降，其补充可改善高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤，因此将其纳入评估模型可从肠-肾轴角度补充代谢调控维度信息。

8、作为本发明的进一步改进，当所述糖尿病肾病进展风险评分≥0.5时，判定受试者具有糖尿病肾病进展高风险，建议进行进一步临床干预；当所述风险评分<0.5时，判定受试者为糖尿病肾病进展低风险。

9、本发明还提供一种基于尿液外泌体多标志物联合检测的糖尿病肾病进展风险评估方法，使用上述任一种试剂盒，包括以下步骤：s1：采集受试者晨起中段尿液样本，在2~8℃条件下以3000×g离心15分钟去除细胞碎片，收集上清液；s2：将上清液加载至所述尿液外泌体分离模块，采用100000×g超速离心70分钟或免疫磁珠捕获法分离获得尿液细胞外囊泡沉淀物；s3：将所述尿液细胞外囊泡沉淀物分为三等份，分别用于txnip蛋白检测、txnip mrna的m6a甲基化水平检测以及tnfsf9/ddit4l蛋白检测；s4：使用所述外泌体txnip蛋白检测模块进行双抗体夹心elisa检测，获得txnip蛋白丰度检测值x1；s5：使用所述外泌体txnip mrna的m6a甲基化水平检测模块进行m6a-merip-qpcr检测，获得txnip mrna的m6a甲基化水平检测值x2；s6：使用所述外泌体tnfsf9蛋白检测模块和外泌体ddit4l蛋白检测模块分别进行双抗体夹心elisa检测，获得tnfsf9蛋白检测值x3和ddit4l蛋白检测值x4；s7：将x1、x2、x3、x4输入所述风险评估模型模块，计算糖尿病肾病进展风险评分，输出评估结果。

10、作为本发明的进一步改进，所述尿液外泌体分离模块还包括外泌体裂解缓冲液，所述外泌体裂解缓冲液含有50mm tris-hcl（ph 7.4）、150mm nacl、1% triton x-100、1mmpmsf以及蛋白酶抑制剂混合物。

11、作为本发明的进一步改进，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品；所述阳性质控品为已知高表达txnip的外泌体标准品；所述阴性质控品为经txnip sirna沉默处理后的外泌体标准品。阳性质控品和阴性质控品的设置可确保每次检测结果的可靠性和可重复性，满足临床检验质量管理要求。

12、本发明的有益效果如下：

13、1.本发明以dkd特异性致病分子txnip作为核心检测靶标，txnip是dkd发生发展中关键的上游致病分子，其上调可通过trx依赖和非依赖双重途径诱导氧化应激和细胞损伤，相较于现有技术中使用的通用性肾损伤标志物，本发明选择的txnip靶标与dkd发病机制直接关联，具有更高的疾病特异性。

14、2.本发明首次将txnip蛋白丰度检测与txnip mrna的m6a甲基化水平检测进行联合，实现了蛋白表达水平与表观遗传修饰水平的双维度检测；m6a甲基化水平变化发生在蛋白丰度变化之前，可作为更早期的分子预警信号，结合蛋白水平的定量信息，显著提高了早期检出灵敏度。

15、3.本发明通过引入tnfsf9和ddit4l作为辅助标志物，分别反映jak1/stat5炎症信号通路和akt/mtor代谢信号通路的异常激活状态，首次实现了从炎症和代谢两个核心维度对dkd进展风险的综合评估，弥补了现有单一维度检测的不足。

16、4.本发明采用非侵入性尿液样本，利用尿液外泌体作为检测载体，外泌体的脂质双分子层结构能够有效保护其内部的蛋白和核酸免受尿液中核酸酶和蛋白酶的降解，保证了检测靶标的稳定性，患者接受度高，适合dkd长期随访管理中的反复检测需求。

17、5.本发明通过logistic回归模型将多个独立标志物的检测结果整合为单一风险评分，以roc曲线的auc≥0.85为标准进行模型优化，为临床医生提供了直观、定量的dkd进展风险评估工具，辅助临床决策。