一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法

本发明属于亚细胞级别的显微操作，特别涉及一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法。

背景技术：

1、膜片钳技术是利用微电极管和细胞膜紧密接触记录微弱的单离子通道电生理信号，被公认为离子通道研究的黄金标准。全细胞膜片钳操作主要分为微管靠近细胞、高阻封接和破膜步骤，以形成全细胞记录模式。在微管将细胞膜片下压的过程中，由于管口尺寸仅为微米级，极易被神经细胞表面和周围的脑组织堵塞，导致后续的高阻封接等操作无法进行。为此操作者在膜片压入的过程中通常在微管内施加一定的正压，使得微管口处产生一个轻微的向外的液流，以吹开神经细胞周围和表面的脑组织，防止微管堵塞。然而这种微管和膜片之间的非接触的液流“吹压”状态并不产生直接的接触力，且在细胞表面产生的形变与常规的接触形变相比，范围显著扩大，幅度明显减小。这给膜片压入过程的检测和精准控制带来很大困难，难以保证正压停止后微管和膜片紧密贴附，从而影响后续高阻封接的形成。因此设计一个在电极压入细胞膜的状态下基于形变和电阻模型的膜片紧密压入方法十分有必要。

技术实现思路

1、本文针对现有膜片钳操作中存在的问题，提出了一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，利用物理建模方法对电极压入过程分别进行细胞膜凹痕形变建模和电极电阻建模，确定凹痕形变和电阻变化趋势及相关性，利用实验数据确定有利于后续高阻封接的紧密压入状态，基于视觉和电学双导引方法和自动化程序形成紧密压入状态。

2、本发明为解决上述问题采用如下的技术方案：

3、一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，所述方法包括以下步骤：

4、s1：通过对电极压入过程进行凹痕形变建模获取细胞膜凹痕的形变趋势：基于johnson经典弹性半空间模型建立细胞膜受力与形变模型，通过分析电极压入过程中细胞膜的形变随受力逐渐增大的变化，获得细胞膜凹痕形变趋势；

5、s2：通过对电极压入过程进行电学建模获取电极电阻的变化趋势：基于电极–细胞体系对电极电阻建立等效电路模型，然后通过代入电极压入过程中不同阶段的凹痕形变结果，获取电极压入细胞过程中的电阻变化趋势；

6、s3：通过结合形变和电阻特征确定有利于高阻封接的紧密压入状态：结合s1、s2获得的凹痕形变和电极电阻两个特征作为压入状态判断，将在不同压入状态阶段中停止电极下压作为实验变量，利用实验数据确定有利于高阻封接的紧密压入状态；

7、s4：通过自动化程序控制电极靠近和紧密压入目标细胞：根据s3中确定的紧密压入状态，对基于视觉和电学双导引的压入状态检测和判断方法的电极压入细胞的控制操作集成于一个与操作者交互的自动化程序，实现自动化膜片紧密压入操作。

8、进一步的，s1中，所述模型中，通过凹痕深度h描述局部细胞膜的最大形变量，通过凹痕半径a描述形变区域的半径，通过压强差描述细胞膜受到电极喷出的液流而导致的内外压强差。

9、进一步的，s2中，建立所述电极—细胞等效电路模型的步骤如下：

10、s201：将测得的电极电阻表达为由电极内部相关电阻、细胞外液通路电阻以及细胞自身等效阻抗共同组成的串并联网络；

11、s202：对各分量在压入过程中的敏感性进行判断，得到压入过程中电极电阻的变化主要取决于电极尖端附近间隙区域电阻的结论；

12、s203：为了对间隙区域电阻进行进一步分析，将电极口与细胞膜之间的间隙区域等效为由电解质溶液填充的狭窄导电通道，将间隙区域电阻与间隙厚度建立定量关系；

13、s204：结合压入过程中不同凹痕形变阶段导致的间隙结构变化，推导和获得间隙区域电阻和电极电阻的变化趋势，从而为后续基于电阻信号的压入状态判别与控制提供电学机理依据。

14、进一步的，s3中，所述压入状态分为三个阶段，第一个状态阶段的特征是无显著月牙形凹痕、电极电阻缓慢上升；第二个阶段的特征是月牙形凹痕显著、电极电阻快速上升；第三个阶段的特征是形成圆形凹痕、电极电阻下降。

15、进一步的，s4中，基于qt creator工具将基于视觉和电学双导引的紧密压入过程编写成一个自动化程序，通过运行所述自动化程序在控制电极压入细胞中自动检测凹痕形变和电阻变化，使电极紧密压入细胞和形成高阻封接。

16、进一步的，在所述自动化程序中，利用目标检测算法对凹痕形变进行检测，电极电阻通过测量电极针尖处施加几毫伏至数十毫伏微小电压脉冲后产生的电流响应来获取；通过设置电极的运动速度和方向使电极逐渐压入细胞膜，在这个过程中，持续检测和判断是否形成紧密压入状态，当判断结果为紧密压入状态时控制电极停止运动，对电极施加负压形成高阻封接。

17、本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

18、1、本发明通过物理建模获取了细胞膜受到电吹压的凹痕形变趋势，填补了现有膜片钳技术在膜片压入力学建模方面的空白；同时，通过电学建模获取了电极压入细胞过程中的电阻变化趋势，与形变趋势形成互补验证关系，提高了建模结果的可靠性与准确性。本发明通过结合形变特征与电学反馈信号，利用实验数据验证确定了有利于高阻封接的紧密压入状态；本发明利用qt creator程序在电极压入细胞的过程中自动检测和判断压入状态，避免了人眼观察的重复性和粗糙性，提高了高阻封接的成功率。

19、2、本发明在平均紧密压入时间为41s左右可实现90%以上的封接成功率，相较于仅基于电学的紧密压入操作提高了28%左右的成功率。

1.一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，其特征在于：s1中，所述模型中，通过凹痕深度h描述局部细胞膜的最大形变量，通过凹痕半径a描述形变区域的半径，通过压强差描述细胞膜受到电极喷出的液流而导致的内外压强差。

3.根据权利要求1所述的一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，其特征在于：s2中，建立所述电极—细胞等效电路模型的步骤如下：

4.根据权利要求1所述的一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，其特征在于：s3中，所述压入状态分为三个阶段，第一个状态阶段的特征是无显著月牙形凹痕、电极电阻缓慢上升；第二个阶段的特征是月牙形凹痕显著、电极电阻快速上升；第三个阶段的特征是形成圆形凹痕、电极电阻下降。

5.根据权利要求1所述的一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，其特征在于：s4中，基于qt creator工具将基于视觉和电学双导引的紧密压入过程编写成一个自动化程序，通过运行所述自动化程序在控制电极压入细胞中自动检测凹痕形变和电阻变化，使电极紧密压入细胞和形成高阻封接。

6.根据权利要求5所述的一种视觉和电学双导引的膜片紧密压入方法，其特征在于：在所述自动化程序中，利用目标检测算法对凹痕形变进行检测，电极电阻通过测量电极针尖处施加几毫伏至数十毫伏微小电压脉冲后产生的电流响应来获取；通过设置电极的运动速度和方向使电极逐渐压入细胞膜，在这个过程中，持续检测和判断是否形成紧密压入状态，当判断结果为紧密压入状态时控制电极停止运动，对电极施加负压形成高阻封接。