一种基于LuAuCOFs功能化ECL适配体传感器及其制备方法和应用

本发明属于电化学发光生物传感，具体涉及一种基于luaucofs功能化ecl适配体传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、马拉硫磷是农业生产中广泛使用的有机磷类农药，主要用于防治作物虫害，对保障农产品产量具有积极作用。但农药不合理施用会导致其在农产品、土壤及水体中形成残留，长期摄入低剂量农药残留会对人体神经系统产生损伤，残留农药经环境扩散还会影响土壤微生物活性与水生生物生存，引发食品安全与生态环境风险。因此，建立快速、灵敏、准确的马拉硫磷残留检测方法具有现实意义。

2、目前马拉硫磷残留的主流检测方法包括色谱法、色谱-质谱联用法及免疫分析法。其中色谱法与色谱-质谱联用法分离效果好、定量准确度高，但样品前处理流程繁琐，仪器体积大、成本高，对操作人员专业要求严格，难以满足现场快速筛查的需求。免疫分析法操作简便、检测周期短，适用于大批量样品初筛，但易受样品基质干扰，检测灵敏度与多组分分析能力有限，难以适配痕量残留的检测场景。

3、电化学发光（ecl）技术通过电极电势驱动发光反应，无需外部光源，具有背景信号低、灵敏度高、发光过程可控的特点，适用于痕量目标物的检测分析。在ecl传感体系中，载体材料直接影响发光试剂的负载效率与信号稳定性，现有部分ecl传感器采用卟啉类材料作为发光载体，存在发光试剂负载不牢固、易受基质环境影响、信号稳定性不足的问题，限制了检测性能的提升。

4、共价有机框架（cofs）是由轻元素通过共价键连接形成的晶态多孔材料，具有比表面积大、孔道结构规整、化学稳定性优异的特点，可为发光试剂与催化组分提供充足负载位点，同时其共轭骨架有利于电子传递，在ecl传感领域具备应用潜力。但目前基于cofs材料构建的马拉硫磷ecl适配体传感体系仍较为缺乏，在信号放大效率、界面稳定性方面仍有优化空间。

技术实现思路

1、针对现有马拉硫磷检测技术操作繁琐、痕量检测灵敏度不足，以及现有ecl传感体系发光载体负载稳定性差、信号放大效率有限的问题，本发明提供一种基于luaucofs功能化ecl适配体传感器及其制备方法和应用，以cofs为功能载体构建信号放大探针，结合适配体的特异性识别作用，实现马拉硫磷的高灵敏、高选择性检测。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种基于luaucofs功能化的电化学发光适配体传感器，包括ito工作电极及修饰于所述ito工作电极表面的传感界面；所述传感界面自下而上依次设置氧化石墨烯层、氨基修饰互补dna层、牛血清蛋白封闭层与apt-luaucofs信号探针层。

4、所述apt-luaucofs信号探针由luaucofs复合材料与巯基修饰的马拉硫磷适配体偶联得到；所述luaucofs复合材料以球形共价有机框架为载体，载体表面负载金纳米颗粒，球形共价有机框架与金纳米颗粒表面负载鲁米诺。

5、进一步地，所述luaucofs复合材料中，金纳米颗粒的质量占比为12%-20%；所述球形共价有机框架的粒径为400-480nm。

6、进一步地，所述马拉硫磷适配体的5'端为巯基修饰，通过au-s键与luaucofs复合材料结合；所述互补dna的5'端为氨基修饰，通过酰胺键固定于氧化石墨烯层表面；所述互补dna与所述马拉硫磷适配体的部分碱基序列互补，使apt-luaucofs信号探针通过碱基杂交固定于传感界面。

7、一种基于luaucofs功能化的电化学发光适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：

8、s1、球形共价有机框架的制备：将1,3,5-三（4-氨基苯基）苯与2,5-二乙烯基对苯二甲醛按质量比1.5-1.7:1溶解于乙腈中，超声至单体完全溶解；加入乙酸作为催化剂，混匀后室温静置反应；反应产物经离心分离，依次采用四氢呋喃、乙醇洗涤，真空干燥后得到球形共价有机框架粉体。

9、s2、au-cof复合物的制备：将球形共价有机框架分散于超纯水中，配制成浓度为1mg/ml的分散液；按球形共价有机框架与四水氯金酸质量比2-3:1加入氯金酸溶液，剧烈搅拌下进行原位还原反应；反应结束后离心洗涤，去除未反应前驱体，得到au-cof复合物。

10、s3、luaucofs复合材料的制备：将au-cof复合物重新分散于超纯水中，按au-cof复合物与鲁米诺质量比50-60:1加入鲁米诺溶液，恒温振荡反应；反应后离心洗涤，去除未结合的鲁米诺，得到luaucofs复合材料。

11、s4、apt-luaucofs信号探针的制备：将luaucofs复合材料配制成分散液，与巯基修饰的马拉硫磷适配体溶液混合，室温温和搅拌反应；反应后离心洗涤，去除未结合的适配体，得到apt-luaucofs信号探针。

12、s5、传感界面逐层构建：将氧化石墨烯分散液滴涂于洁净的ito工作电极表面，干燥后滴加edc与nhs的混合溶液，活化氧化石墨烯表面的羧基基团；随后滴加氨基修饰的互补dna溶液孵育，使互补dna通过酰胺键共价固定；再滴加牛血清蛋白溶液孵育，封闭电极表面残余活性位点；最后滴加apt-luaucofs信号探针溶液孵育，使探针与互补dna发生碱基互补杂交；洗涤后制得所述电化学发光适配体传感器。

13、进一步地，步骤s1中，乙酸的浓度为10-12mol/l，室温静置反应时间为60-80h；真空干燥温度为50-70℃，干燥时间为10-14h。

14、进一步地，步骤s2中，原位还原反应的搅拌时间为20-40min。

15、进一步地，步骤s3中，振荡反应温度为20-30℃，振荡转速为150-250rpm，反应时间为7-9h。

16、进一步地，步骤s4中，室温搅拌反应时间为5-7h。

17、进一步地，步骤s5中，edc浓度为8-12mmol/l，nhs浓度为18-22mmol/l，羧基活化时间为20-40min；互补dna孵育温度为2-6℃，孵育时间为10-14h；牛血清蛋白的质量分数为0.8%-1.2%，封闭时间为0.5-1.5h；探针杂交孵育温度为35-39℃，孵育时间为20-40min。

18、本发明还提供所述基于luaucofs功能化的电化学发光适配体传感器在马拉硫磷残留检测中的应用。

19、进一步地，检测时以含过氧化氢的碳酸盐缓冲液作为检测底液，采用双电位阶跃法采集电化学发光信号；检测的线性范围为1.0×10-10-1.0×10-4mg/ml，检出限为5.0×10-11-6.0×10-11mg/ml。

20、本发明的有益效果：

21、1、本发明以球形cofs作为载体材料，可稳定负载金纳米颗粒与鲁米诺发光试剂，结合金纳米颗粒的催化作用提升ecl反应效率，实现发光信号的稳定放大，改善了传统载体负载稳定性差、信号强度不足的问题。

22、2、本发明采用适配体作为特异性识别元件，通过互补dna杂交的方式固定信号探针，靶标结合后可引发探针构象变化调控ecl信号，对马拉硫磷具有优异的识别特异性，抗基质干扰能力强，适用于复杂样品体系的检测。

23、3、本发明的制备工艺参数可控，制备的传感器批次重复性好，检测线性范围宽、检出限低，可实现马拉硫磷的痕量检测，且操作流程简便，无需复杂的样品前处理，可为农产品中马拉硫磷残留的快速检测提供可行的技术方案。