一种用于快速筛查动物性食品中3-氨基苯乙醚残留的双识别亲和层析试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明涉及食品安全检测领域，尤其涉及一种用于快速筛查动物性食品中3-氨基苯乙醚残留的双识别亲和层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

1、乙氧酰胺苯甲酯作为一种广泛使用的抗球虫药物，在禽类养殖中应用十分普遍。其在动物体内代谢缓慢，易在肝脏、肾脏及肌肉组织中蓄积残留，对食品安全构成严重威胁。我国《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（gb 31650-2019）和美国食品药品监督管理局（21cfr 556.260）均明确规定，乙氧酰胺苯甲酯的残留标志物为3-氨基苯乙醚，3-氨基苯乙醚也称间氨基苯乙醚，鸡肉中的最大残留限量为500 μg/kg，鸡肝和鸡肾为1500μg/kg。因此，建立快速、准确、灵敏的动物性食品中3-氨基苯乙醚残留检测方法，对保障食品安全与公众健康具有重要的现实意义。

2、目前，针对3-氨基苯乙醚的检测方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法及液相色谱-质谱联用法等。这类仪器分析方法检测灵敏度高、定性定量准确，能够满足痕量残留的精准检测要求。然而，其操作流程复杂、检测周期较长、仪器设备昂贵且维护成本高，对操作人员的专业技能要求较高，难以满足基层监管及食品加工企业现场快速筛查的需求。

3、免疫分析技术中，酶联免疫吸附试验与免疫层析试纸条是两种主流方法。其中，免疫层析试纸条因操作简便、检测快速、成本低廉、便携性好，且无需大型仪器与专业操作技能，已被广泛应用于动物性食品中兽药、农药及其他有害小分子残留的现场快速筛查。然而，当前多数试纸条产品仅采用单一识别元件，在实际应用中存在明显的技术缺陷：一是分子识别特异性不足，对小分子痕量残留的检测灵敏度难以满足实际要求；二是基质抗干扰能力弱，在动物性食品复杂基质中易发生非特异性吸附与信号干扰，严重影响检测结果的可靠性。此外，传统亲和层析试纸条多局限于定性或半定量判断，难以实现对残留物的精准定量分析，检测精准性与稳定性仍有待进一步提升。

4、因此，如何克服单一识别元件的固有缺陷，提升免疫层析试纸条的灵敏度、特异性及抗基质干扰能力，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种3-氨基苯乙醚双识别亲和层析试纸条的制备方法，该方法基于抗体-适配体双识别策略，通过将抗体与适配体进行协同组合，充分发挥抗体高亲和力与适配体高稳定性的互补优势，有效克服单一识别元件的技术缺陷。

2、本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制得的3-氨基苯乙醚双识别亲和层析试纸条。

3、本发明的又一目的在于提供上述试纸条在检测动物性食品中3-氨基苯乙醚的应用。

4、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

5、第一方面，本发明提供一种3-氨基苯乙醚双识别亲和层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

6、步骤1，半抗原的合成：以4-乙氧基苯酚为原料，经硝化和还原反应，合成2-氨基-4-乙氧基苯酚；

7、步骤2，完全抗原的合成：将步骤1所得2-氨基-4-乙氧基苯酚依次经氨基保护、引入间隔臂、与载体蛋白偶联、保护基脱除及纯化，得到完全抗原；

8、步骤3，抗体的制备：以步骤2所得完全抗原为免疫原，免疫动物，制备特异性识别3-氨基苯乙醚的单克隆抗体或多克隆抗体；

9、步骤4，适配体的筛选与评价：以3-氨基苯乙醚为靶标，通过selex技术筛选获得特异性识别3-氨基苯乙醚的核酸适配体，所述筛选包括正向筛选和反向筛选步骤；

10、步骤5，抗体-适配体偶联：采用戊二醛法，将步骤3所得抗体与步骤4所得核酸适配体进行共价偶联，制备抗体-适配体偶联物；

11、步骤6，纳米金标记物的制备：将步骤5所得抗体-适配体偶联物标记于纳米金颗粒上，得到纳米金标记的抗体-适配体复合物；

12、步骤7，双识别亲和层析试纸条的组装：将步骤6所得纳米金标记的抗体-适配体复合物喷涂于玻璃纤维素膜上，干燥后制得金标结合垫；在硝酸纤维素膜上分别包被适配体作为检测线、二抗作为质控线；将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次搭接粘贴于底板上，裁切后即得。

13、作为优选方案，步骤3中，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no:1、seq id no:5或seq id no:9所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no:3、seq id no:7或seq id no:11所示；所述重链可变区的核苷酸编码序列分别如seq id no:2、seq id no:6或seq id no:10所示，轻链可变区的核苷酸编码序列分别如seq id no:4、seq id no:8或seq id no:12所示；所述单克隆抗体可变区基因的pcr扩增引物选自以下引物中的任意一对或多对：重链可变区上游引物vh-f1至vh-f10的核苷酸序列分别如seq id no:23至seqid no:32所示；重链可变区下游引物vh-r1至vh-r10的核苷酸序列分别如seq id no:33至seq id no:42所示；轻链可变区上游引物vl-f1至vl-f10的核苷酸序列分别如seq id no:43至seq id no:52所示；轻链可变区下游引物vl-r1至vl-r10的核苷酸序列分别如seq idno:53至seq id no:62所示。

14、作为优选方案，步骤4中，所述核酸适配体的核苷酸序列为seq id no:13至seq idno:22中的任意一种。

15、作为优选方案，步骤1中，所述半抗原的合成具体包括：取6-9 g 4-乙氧基苯酚溶于有机酸类溶剂中，滴加浓硝酸，所述4-乙氧基苯酚与浓硝酸的摩尔比为1:1.1-1.5，反应1-2 h，经析晶、过滤、洗涤、重结晶，得4-乙氧基-2-硝基苯酚；取上述产物溶于无水乙醇，加入10%钯/碳催化剂，常压通入氢气室温反应4-6 h，经过滤、旋蒸、柱层析纯化，得2-氨基-4-乙氧基苯酚。

16、作为优选方案，步骤2中，所述完全抗原的合成具体包括：

17、步骤2a，氨基保护：取0.98-3.45 g 2-氨基-4-乙氧基苯酚溶解于有机溶剂中，加入三乙胺，搅拌均匀后加入2.15-5.48 g二碳酸二叔丁酯，室温搅拌反应6-8 h，经萃取、洗涤、干燥、旋蒸、柱层析纯化，得2-(叔丁氧羰基氨基)-4-乙氧基苯酚；所述三乙胺与2-氨基-4-乙氧基苯酚的摩尔比为1-3:1，二碳酸二叔丁酯与2-氨基-4-乙氧基苯酚的摩尔比为1.2-1.5:1；

18、步骤2b，加入间隔臂：取1.2-2.8 g步骤2a产物溶解于有机溶剂中，加入碳酸钾搅拌30 min，再加入0.95-1.64 g间隔臂，升温至60-80℃反应8-16 h，经酸调ph、萃取、洗涤、干燥、旋蒸、柱层析纯化，得羧基产物；所述间隔臂为6-溴己酸、7-溴庚酸、8-溴辛酸、10-溴癸酸、对(溴甲基)苯甲酸或碘辛酸中的任意一种；

19、步骤2c，与载体蛋白偶联：采用活泼酯法，将步骤2b产物8.0-20 mg溶解于有机溶剂中，加入9.5-15.7 mg n-羟基琥珀酰亚胺和17-23.8 mg n,n-二环己基碳二亚胺，室温搅拌1-2 h，将活性酯溶液滴加至载体蛋白溶液中，室温搅拌反应12-16 h；所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；

20、步骤2d，保护基脱除：将步骤2c偶联物溶于有机溶剂中，加入酸性脱保护溶液，室温搅拌2-4 h，调节ph至中性，得到偶联物溶液；

21、步骤2e，纯化：将步骤2d反应液透析、离心，收集上清液，即得完全抗原。

22、作为优选方案，步骤5中，所述抗体-适配体偶联物的制备方法为：取40-100 μl抗体溶于磷酸盐缓冲液中，取8-20 nmol氨基修饰的核酸适配体溶于磷酸盐缓冲液中，将抗体与适配体溶液混合，逐滴加入25%戊二醛水溶液至终浓度0.05%-0.25%，室温或4℃避光反应2-12 h，加入甘氨酸溶液终止反应，经超滤离心管纯化，即得抗体-适配体偶联物。

23、作为优选方案，步骤6中，所述纳米金标记物的制备包括：取0.01%-0.1%氯金酸溶液加热至沸腾，加入1%-5%柠檬酸三钠溶液1-10 ml，继续搅拌加热20-30 min至溶液呈透亮红色，冷却后调节ph至7.0-8.0，加入抗体-适配体偶联物室温避光孵育30-60 min，经牛血清蛋白封闭后离心，沉淀用金标稀释液溶解，即得纳米金标记的抗体-适配体复合物。

24、第二方面，本发明提供一种由上述制备方法制得的3-氨基苯乙醚双识别亲和层析试纸条。

25、第三方面，本发明提供上述试纸条在检测动物性食品中3-氨基苯乙醚的应用，包括以下步骤：

26、步骤1，样品前处理：将待测动物性食品样品与含乙酸的有机溶液混合，加入盐析剂，经涡旋和离心后获得上清液；取所述上清液加入分散固相萃取吸附剂，经涡旋和离心后获得净化液，过滤即得待测液；

27、步骤2，检测：将步骤1所得待测液滴加至试纸条样品垫上，5-10 min内判读结果；

28、步骤3，结果判读：若质控线显色而检测线不显色，则判断为阳性；若质控线和检测线均显色，则判断为阴性；若质控线不显色，则判断为无效。

29、作为优选方案，步骤1中，所述待测动物性食品为鸡肉、鸡蛋、鸡肝或鸡肾中的任意一种；所述有机溶液为含0.5%-2%乙酸的乙腈溶液；所述盐析剂为无水硫酸镁和氯化钠，或无水硫酸镁和醋酸钠；所述分散固相萃取吸附剂为n-丙基乙二胺、石墨碳黑和十八烷基硅胶中的任意一种或几种；步骤3中，还包括将层析后的试纸条置于读数仪中，读取检测线与质控线的光密度比值，代入预先建立的标准曲线，计算样品中3-氨基苯乙醚的浓度。

30、根据上述技术方案，本发明的有益效果是：

31、1.本发明基于抗体-适配体双识别策略构建亲和层析试纸条，有效克服了单一识别元件的技术缺陷，突破了传统单一识别试纸条的技术瓶颈，丰富和拓展了亲和层析试纸条的设计思路与制备技术。所制备的双识别亲和层析试纸条兼顾了检测的快速性、特异性和灵敏度，可实现动物性食品中3-氨基苯乙醚的现场快速筛查和半定量检测，具有检测周期短、操作简便、成本低廉等突出优势，能够满足基层监管部门、养殖企业、食品加工企业及第三方检测机构的多样化检测需求。该试纸条的推广应用，填补了现有该类小分子快速检测技术的空白，有助于完善动物性食品残留监控体系，提升我国动物性食品质量安全水平，推动畜牧业产业绿色、健康、可持续发展。

32、2.本发明采用抗体与适配体协同组合的双识别策略，克服了传统单一识别元件试纸条在动物性食品复杂基质中易发生非特异性吸附、交叉反应率高的缺陷。经测试，本试纸条与3-氨基苯乙醚主要结构类似物的交叉反应率均低于1%，且在实际样品（鸡肉、鸡肝和鸡蛋等）中加标回收率80%以上，相对标准偏差小于10%，表明其具有优异的识别特异性和基质抗干扰能力。

33、3.本试纸条对3-氨基苯乙醚的灵敏度较高，远低于我国gb 31650-2019规定的最大残留限量（鸡肉500 μg/kg、鸡肝和鸡肾1500 μg/kg）；整个检测过程仅需10 min即可判读结果，操作简便、无需大型仪器设备，克服了传统仪器分析法（高效液相色谱法、质谱联用法等）检测周期长、设备昂贵、难以现场应用的不足，适用于快速筛查需求。

34、4.本试纸条在25℃下保存3个月、37℃下保存1个月后，显色效果和检测灵敏度均无明显变化，具有良好的储存稳定性，填补了现有3-氨基苯乙醚小分子快速检测技术的空白，为动物性食品中乙氧酰胺苯甲酯残留标志物的监控提供了高效、便捷的现场检测工具，有助于完善兽药残留监控体系，保障食品安全。