一种粪便保存液及其制备方法与流程

本发明涉及生物，更具体地，涉及一种粪便保存液及其制备方法。

背景技术：

1、在结直肠癌筛查、炎症性肠病评估等场景中，对患者粪便样本进行无创采集、常温运输与长期保存。保存后的样本需适用于全自动生化分析仪，通过免疫比浊法同时对粪便中的不稳定蛋白标志物（如血红蛋白和钙卫蛋白）进行定量检测。粪便成分复杂，不同蛋白降解路径不同，若需检测多个指标，临床通常需分装多份样本，使用不同的保存管，增加了采样复杂度、物流成本及患者负担。

2、血红蛋白在常温下极易氧化变性，而钙卫蛋白则易被粪便中丰富的蛋白酶降解。现有通用保存液或仅针对核酸，或仅考虑单一蛋白，缺乏能同时保护这两种特性迥异蛋白的方案。导致常温长期保存后检测准确性差：市售保存液在常温（20 °c~30 °c）条件下，保存期短（通常要求24 h~72 h内检测）。超过期限后，目标蛋白降解或构象改变，导致使用高精度的免疫比浊法检测时，结果出现显著偏差（假阴性），无法满足样本长途运输或集中检测的临床需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种粪便保存液及其制备方法，通过单一种保存液中同时实现血红蛋白与钙卫蛋白的稳定，显著提升常温长期保存后两种蛋白的检测残存率。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

3、一种粪便保存液，包括：0.5 μm~5 μm丝氨酸蛋白酶抑制剂、0.075 mm~1.25 mm金属蛋白酶抑制剂、0.1 mm~5 mm抗氧化剂、10 g/l~50 g/l蛋白稳定剂、1 g/l~10 g/l防腐剂、1 g/l~10 g/l表面活性剂、0.1 g/l~20 g/l等渗调节剂、10 mm~100 mm缓冲剂和余量的溶剂；

4、所述抗氧化剂包括第一抗氧化剂和第二抗氧化剂，所述第一抗氧化剂包括抗坏血酸钠、尿酸、l-谷胱甘肽中的一种或两种以上，所述第二抗氧化剂包括硫代硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、α-硫辛酸中的一种或两种以上，所述第一抗氧化剂与所述第二抗氧化剂的摩尔比为1.5~2.5:1；

5、所述丝氨酸蛋白酶抑制剂和所述金属蛋白酶抑制剂的摩尔比为1:150~250。

6、一种如上述的粪便保存液的制备方法，包括：将蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、蛋白稳定剂、防腐剂、表面活性剂、等渗调节剂、缓冲剂溶于溶剂中，得到所述粪便保存液。

7、实施本发明实施例，将具有如下有益效果：

8、本发明针对粪便样本中血红蛋白氧化变性、钙卫蛋白酶解降解两条失效路径，提供一个能同时对抗氧化和蛋白酶降解的稳定微环境，具体如下：

9、（1）钙卫蛋白易被丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶降解，本发明通过丝氨酸蛋白酶抑制剂与金属蛋白酶抑制剂共同构成蛋白酶抑制体系，二者联合使用协同增效。丝氨酸蛋白酶抑制剂通过共价修饰直接抑制丝氨酸蛋白酶的活性中心，金属蛋白酶抑制剂通过整合钙、锌等二价金属离子，使金属依赖型蛋白酶失活，丝氨酸蛋白酶抑制剂与金属蛋白酶抑制剂联合从不同通路阻断对钙卫蛋白等靶标的酶切降解。

10、（2）抗氧化剂由第一抗氧化剂与第二抗氧化剂按1.5~2.5:1的摩尔比复配构成，第一抗氧化剂直接清除活性氧自由基并还原氧化态血红蛋白，快速发挥抗氧化作用，第二抗氧化剂持续消耗体系氧化性物质、维持低氧化还原电位，延长抗氧化作用时效，二者协同增效，在0.1mm~5mm的低总浓度下即可满足血红蛋白的氧化稳定需求，同时避免强还原环境破坏钙卫蛋白的天然构象。

11、（3）金属蛋白酶抑制剂能同时保护血红蛋白和钙卫蛋白：金属蛋白酶抑制剂的核心作用是螯合金属离子、抑制金属蛋白酶，保护钙卫蛋白，同时它还能螯合粪便中游离的金属离子，如铁离子，游离铁会通过芬顿反应催化产生强氧化性的羟基自由基，加速血红蛋白氧化。金属蛋白酶抑制剂即直接保护了钙卫蛋白，又通过减少自由基生成辅助保护了血红蛋白。

12、（4）抗氧化剂能同时保护血红蛋白和钙卫蛋白：抗氧化剂的核心作用是保护血红蛋白不被氧化，同时它们能维持溶液的还原环境，因此避免丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性中心被氧化失活，延长丝氨酸蛋白酶的有效作用时间，间接增强了对钙卫蛋白的保护效果。

13、（5）蛋白稳定剂用于通过空间占位与分子保护层效应，减少血红蛋白与钙卫蛋白的界面吸附损失和热聚集变性，维持二者的天然构象与免疫活性。

14、综上，本发明提供的粪便保存液通过单一种保存液同时实现血红蛋白与钙卫蛋白的有效稳定，显著提升常温长期保存后两种蛋白的检测残存率，保障免疫比浊法检测结果的准确性，满足粪便样本常温运输与集中检测的临床应用需求。

1.一种粪便保存液，其特征在于，包括：0.5 μm~5 μm丝氨酸蛋白酶抑制剂、0.075 mm~1.25 mm金属蛋白酶抑制剂、0.1 mm~5 mm抗氧化剂、10 g/l~50 g/l蛋白稳定剂、1 g/l~10g/l防腐剂、1 g/l~10 g/l表面活性剂、0.1 g/l~20 g/l等渗调节剂、10 mm~100 mm缓冲剂和余量的溶剂；

2.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂包括磺酰氟类抑制剂和/或多肽蛋白类抑制剂。

3.根据权利要求2所述的粪便保存液，其特征在于，所述磺酰氟类抑制剂包括4-（2-氨乙基）苯磺酰氟和/或苯甲基磺酰氟；

4.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述金属蛋白酶抑制剂包括乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸铁钠、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸中的一种或两种以上。

5.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述蛋白稳定剂包括惰性蛋白稳定剂和多羟基保护剂，所述惰性蛋白稳定剂的浓度为5 g/l~20 g/l，多羟基保护剂用量为5g/l~30 g/l。

6.根据权利要求5所述的粪便保存液，其特征在于，所述惰性蛋白稳定剂包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明胶、酪蛋白中的一种或两种以上；

7.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述防腐剂包括山梨酸钾、苯甲酸钠、proclin300、bnd-10、proclin950中的一种或两种以上。

8.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述表面活性剂包括曲拉通x-100、吐温-20、吐温-80、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐中的一种或两种以上。

9.根据权利要求1所述的粪便保存液，其特征在于，所述等渗调节剂包括氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或两种以上。

10.一种如权利要求1~9中任意一项所述的粪便保存液的制备方法，其特征在于，包括：将蛋白酶抑制剂、抗氧化剂、蛋白稳定剂、防腐剂、表面活性剂、等渗调节剂、缓冲剂溶于溶剂中，得到所述粪便保存液。