一种多奈哌齐微球中细菌内毒素的检测方法与流程

本发明属于药物分析检测，具体涉及一种多奈哌齐微球中细菌内毒素的检测方法。

背景技术：

1、多奈哌齐，化学名称为(±)2,3-二氢-5,6-二甲氧基-2-{[(1-苯甲基)-4-哌啶基]甲基}-1h-茚-1-酮，结构如下所示，属于一种乙酰胆碱酯酶抑制剂，广泛用于疗中枢神经系统退行性疾病，如轻度或中度阿尔茨海默型痴呆症状的治疗，

2、。

3、将多奈哌齐制备成plga微球注射剂，可实现药物的长效缓释，提升患者用药的依从性。然而，与普通注射剂不同，微球制剂是将有效成分包裹于微球内，作为注射剂关键指控指标的细菌内毒素也可能被包封于微球内。细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的致热物质，其进入人体微量即可引发强烈的发热反应，甚至导致危及生命的脓毒症与多器官衰竭。对于注射剂而说，例如多奈哌齐微球制剂，细菌内毒素的检测至关重要。一方面，微球制剂工艺复杂、步骤多，引入内毒素的风险增加；另一方面，药物在体内长期滞留，若出现后期微球骨架降解导致内毒素突释，将引发远超普通注射剂更严重的临床后果。因此，对微球内毒素的准确定量，是保证药品质量和安全的重要检测项。

4、现有技术中，细菌内毒素的检测通常采用常规的鲎试剂法。但在对多奈哌齐plga微球进行检测时，常规鲎试剂法存在以下检测缺陷，导致无法准确检测：一是主药的干扰，多奈哌齐为有机碱，能够直接抑制鲎试剂的酶促反应，造成假阴性结果与回收率偏低；二是载体的干扰，plga微球疏水性强，在水相中难溶解且分散不均匀，极易吸附内毒素或鲎试剂；同时，plga降解产生的酸性环境也会进一步抑制酶促反应，二者形成协同干扰，且该干扰无法通过常规的稀释法进行消除；三是包封与取样的干扰，内毒素被包裹于微球的内部，常规水溶法无法完全溶解微球使得内毒素释放不完全，加上微球制剂多为混悬体系，取样的代表性较差，导致检测结果偏差大、重现性差。上述缺陷，导致采用药典常规的方法检测时，细菌内毒素的回收率严重偏离50~200%的合格范围，常规鲎试剂法不适用于多奈哌齐plga微球中细菌内毒素的检测。

5、除了上述复杂基质的干扰，多奈哌齐微球检测时还存在以下问题：使用水相或缓冲液稀释法，操作简便、符合药典常规操作，但无法破坏plga微球骨架，包封的内毒素无法充分释放；常规表面活性剂（如吐温-80）处理法，该法虽能在一定程度上可改善疏水微球的分散状态，但仍无法彻底溶解微球以完全释放内毒素，且对多奈哌齐分子直接抑制鲎试剂的干预作用非常有限，回收率仍无法达到药典标准；常规有机溶剂水溶液法，虽可溶解plga微球骨架，但由于plga具备极强的疏水性，当按照鲎试剂法要求加水稀释至检测浓度时，溶解的plga极易发生再次析出，形成不溶性聚集物，使得已被释放的内毒素被二次吸附，最终导致回收率不符合要求。

6、因此亟需建立一种准确、灵敏且专属性强的细菌内毒素的定量检测方法。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种多奈哌齐微球中细菌内毒素的检测方法，该方法使用专属复合前处理介质结合动态显色基质法，通过精准配伍前处理的基质体系，先将微球完全溶解、内毒素充分释放与干扰高效中和，实现多奈哌齐微球中细菌内毒素准确、可靠的定量检测，满足药品研发和放大生产的质控需求。

2、本发明的技术方案为：一种多奈哌齐微球中细菌内毒素的检测方法，包含如下步骤：取待测样品多奈哌齐微球，加入混合溶剂涡旋、超声至澄清，得到有机相；然后向有机相中加入复合前处理介质，稀释至一定浓度；采用动态显色基质法，在恒温孵育条件下实时监测405 nm处吸光度的变化，记录反应达到阈值od的时间，结合标准曲线计算内毒素浓度。

3、所述方法中，混合溶剂选自二甲基亚砜与三氯甲烷、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷中的任一种组成的混合溶剂，二者的体积比为1:0.5~2。

4、优选地，所述方法中，多奈哌齐微球的重量与混合溶剂的体积比为50~100:1，其中质量以mg，体积以ml计。

5、所述方法中，复合前处理介质包含高离子强度缓冲液、ph调节剂和有机溶剂。

6、优选地，所述方法中，复合前处理介质进一步含有两性离子表面活性剂。

7、进一步优选地，所述方法中，两性离子表面活性剂选自chaps、chapso、zwittergent 3-10、zwittergent 3-12中的一种或多种。

8、更为优选地，所述方法中，两性离子表面活性剂为chaps。

9、其中，两性离子表面活性剂的具体内容如下：

10、chaps：3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，

11、chapso：3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸内盐，

12、zwittergent 3-08：n-辛基-n,n-二甲基-3-氨-1-丙磺酸内盐，

13、zwittergent 3-10：n-癸基-n,n-二甲基-3-氨-1-丙磺酸内盐，

14、zwittergent 3-12：3-(n,n-二甲基十二烷基铵)丙烷磺酸盐，

15、zwittergent 3-14：3-(n,n-二甲基十四烷基铵)丙烷磺酸盐。

16、进一步优选地，所述方法中，两性离子表面活性剂在前处理介质中的质量浓度为0.1%～2.0%（w/v），其中质量是g，体积是ml计。

17、更为优选地，所述方法中，两性离子表面活性剂在前处理介质中的质量浓度为0.2%～0.7%（w/v），其中质量是g，体积是ml计。

18、优选地，所述方法中，高离子强度缓冲液为含mg2+和k+的tris缓冲液。

19、进一步优选地，所述方法中，tris-hcl缓冲液的浓度为10～100 mmol/l，mgcl2的浓度为20～100 mmol/l，kcl的浓度为50～150 mmol/l。

20、更为优选地，所述方法中，mgcl2的浓度为40～60 mmol/l，kcl的浓度为80～120mmol/l。

21、优选地，所述方法中，ph调节剂选自盐酸或氢氧化钠溶液。

22、进一步优选地，所述方法中，ph调节剂的ph值为6.5～7.8。

23、更进一步优选地，所述方法中，ph调节剂的ph值为6.9～7.3。

24、优选地，所述方法中，复合前处理介质中的有机相溶剂选自二甲基亚砜、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷中的任一种。

25、进一步优选地，所述方法中，复合前处理介质中的有机相溶剂选自二甲基亚砜、二氯甲烷和乙腈的任一种。

26、优选地，所述方法中，复合前处理介质中的有机相溶剂在前处理介质中的体积分数为3%～15%。

27、进一步优选地，所述方法中，复合前处理介质中的有机相溶剂在前处理介质中的体积分数为3%～8%。

28、优选地，所述方法中，向有机相中加入复合前处理介质，稀释至有机溶剂终浓度不高于5%。

29、本发明中使用的多奈哌齐微球可以使用现有技术制备，例如cn120267621b中制备的多奈哌齐缓释微球，不限定多奈哌齐微球的制备方法。

30、本发明所使用的多奈哌齐微球可采用本领域现有的常规工艺制备。例如，可采用cn120267621b中公开的多奈哌齐缓释微球的制备方法，本发明对所述多奈哌齐微球的具体制备方法不作限定。无论采用何种工艺制得的多奈哌齐微球，均可采用本发明提供的内毒素检测方案进行准确定量。

31、本发明与现有技术相比具有如下突出优点：

32、1、本发明使用复合溶解-释放-中和前处理介质对样品进行预处理，可同步实现plga微球完全溶解、内毒素充分释放及药物与载体双重干扰的高效中和；

33、2、本发明预处理后的样品，采用动态显色基质法进行定量检测，通过实时监测显色反应动力学曲线计算内毒素含量，同时配套建立加标微球回收率试验、干扰物阳性对照试验及取样均一性验证体系，能够实现取样均一性，确保检测方法的准确性、可靠性与耐用性。