一种同时检测E2和P4的双通道纸基微流控电化学适配体传感平台及检测方法

本发明涉及一种体外诊断与生物传感，具体涉及一种在纸基微流控器件上设置两个空间分离的电化学检测通道，并利用靶标特异性核酸适配体分别识别雌二醇e2和孕酮p4的检测平台。

背景技术：

1、雌二醇e2和孕酮p4是女性生殖内分泌调控中的关键甾体激素，其生物合成和代谢属于人类甾体生成网络的重要组成部分。两者在卵泡发育、排卵、子宫内膜周期性变化及妊娠维持等过程中发挥协同作用。其中，e2 主要由发育中的卵泡分泌，其水平在卵泡期逐渐升高，并在排卵前后达到较高水平，参与卵泡成熟、排卵的相关调控及子宫内膜增殖；p4 主要在排卵后由黄体分泌，在妊娠期亦可由胎盘产生，其水平于黄体期升高，促进子宫内膜由增殖期向分泌期转化，并参与妊娠早期的内分泌支持。e2 和 p4 在月经周期、辅助生殖治疗及妊娠等不同生理或临床状态下呈现具有时序性的动态变化。两者在同一时间点的联合水平及其连续变化趋势，可辅助反映卵泡发育与卵巢反应、排卵状态、黄体功能以及妊娠相关内分泌状态。相比于仅检测单一激素，同时获得 e2 和 p4 的检测结果更有利于形成较完整的生殖内分泌信息。因此，在辅助生殖、排卵监测、黄体功能评估及妊娠相关激素监测等应用场景中，存在对 e2 和 p4 进行同步、快速和低样本量检测的实际需求。

2、现有临床检测主要依赖化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析和液相色谱–串联质谱等技术。上述方法能够提供可靠结果，但通常依赖集中式实验室、自动化分析仪器、专业操作人员和相对复杂的样品流转。e2 和 p4 常被作为两个独立项目检测，既增加操作和设备负担，也不利于近患者、低成本和重复监测。质谱法的特异性 较高，但仪器昂贵、方法建立与维护要求高；免疫分析较易自动化，却仍可能受到交叉反应、试剂的批间差异和检测平台限制。纸基微流控芯片以纸张或纤维素材为基底，利用亲/疏水图案、纸纤维孔道和毛细作用实现小体积液体的定向输运、分配和反应。国内外综述研究指出，纸张具有来源广泛、成本低、可降解、生物相容性较好及无需外部驱动即可形成毛细输运等特点，纸基微流控芯片可与比色、荧光、化学发光和电化学分析等方法结合，已在医疗服务、环境检测和资源受限场景快速检测中显示应用潜力。与传统硅、玻 璃或聚合物微流控芯片相比，纸基平台更适合一次性、低成本和小样本量检测，但现有研究仍需进一步解决器件批量制备一致性、复杂基质适用性、多指标集成和现场定量读出等问题。

3、在纸基电化学适配体传感领域，已有研究者报道了基于碳纳米材料/氧化还原分子/金纳米颗粒复合界面的单激素检测方案。然而，该类方案存在以下固有局限：

4、第一，检测通量为单一靶标。已报道的纸基电化学适配体传感器主要针对单一激素（如e2）进行检测，无法在同一器件中同时提供e2与p4的联合内分泌信息。在辅助生殖和排卵监测中，e2与p4的比值及其协同变化趋势比单一激素水平具有更重要的临床意义。虽然已有研究分别报道了e2适配体修饰金电极传感器和p4无标记阻抗适配体传感器，但将两种识别体系集成于同一纸基器件中，需要解决液路分配、电极独立性和信号串扰等多重问题。

5、第二，未涉及双靶标浓度尺度的兼容设计。e2的临床解释尺度通常在pg/ml级别，而p4在排卵后常处于ng/ml级别，两者相差约三个数量级。简单地将两个单靶标传感器拼接到同一芯片上，无法自然获得兼容的定量窗口。每个靶标的适配体探针密度需要针对其各自的浓度范围和结合亲和力进行独立优化，而这种“非对称”的差异化设计策略在已有的纸基适配体传感器研究中未见报道。

6、第三，复杂血清基质中的适用性未得到充分验证。多数纸基电化学适配体传感器在缓冲液体系中获得验证，但血清蛋白和其他基质成分会引起非特异吸附和传质变化，使缓冲液标定结果难以直接转用于临床样品。已有可穿戴适配体纳米生物传感器展示了女性激素无创监测潜力，但其器件形态、样本体系与本发明的纸基血清检测不同。部分生物流体验证方案需要百倍或千倍稀释、过滤、离心等预处理，增加了操作复杂度，不利于分散式检测场景的应用。

7、第四，适配体固定浓度的选择缺乏系统优化。现有研究在将适配体固定于电极表面时，通常直接采用文献报道的浓度或简单套用单一靶标传感器的优化结果，未考虑多靶标集成场景下各靶标适配体浓度需要独立优化的客观需求。适配体浓度过低会导致靶标结合位点不足、灵敏度下降；浓度过高则可能导致表面探针拥挤、靶标进入受阻、构象受限，反而使响应下降。这一矛盾在多靶标同时检测时更为突出。

8、国内相关工作也表明，纸基微流控与柔性电极、丝网印刷电极及便携读出电路 具有良好的组合空间。例如，基于纸基微流控的可穿戴汗液 ph 传感器研究中，三明治纸基微流控芯片利用滤纸毛细效应进行汗液采样、导流、检测和排出，并通过吸油纸层过滤皮脂，报道了约 25 µl 样本响应体积和 90% 以上皮脂过滤效果，体现了纸基流路在微量生物流体处理和连续检测中的价值。又如，基于丝网印刷 mxene 的纸基微流控重金属电化学传感器研究中，研究者通过蜡印形成亲水检测区，采用丝网印刷制备 mxene 工作电极、碳对电极和 ag/agcl 参比电极，并结合折纸式纸基微流控结构用于 cd(ii) 和 pb(ii) 的同时快速检测，说明纸基微流控与丝网印刷三电极体系可用于现场电化学分析。上述研究为本发明采用蜡印纸基流路、丝网印刷三电极和小体积样品输运提供了相关技术背景；但其检测对象、识别元件和信号界面与 e2/p4 双激素适配体检测不同，尚不能解决双甾体激素在同一纸基器件中的 独立识别、独立标定和复杂血清基质定量问题。

9、双激素检测还面临三类共性困难。第一，e2 和 p4 分子量小，并与雌酮、雌三 醇、孕烯醇酮、皮质醇、醛固酮及胆固醇等内源性甾体具有相似骨架，识别元件需具 有足够的分子辨别能力。第二，两者的临床浓度尺度不同：e2 常在 pg ml-1 尺度解 释，而 p4 在排卵后常处于  ng ml-1 尺度，简单地把两个单指标检测拼接起来并不 能自然获得兼容的定量窗口。第三，血清蛋白和其他基质成分会引起非特异吸附和 传质变化，使缓冲液标定结果难以直接转用于临床样品。

10、核酸适配体能够通过可重复合成的寡核苷酸序列识别小分子靶标，具有化学稳定性较好、便于巯基等基团修饰以及易与电化学界面耦合的特点；将适配体识别与 纸基微流控结合，已被认为是发展低成本、便携式分析器件的重要方向。针对甾体激素检测，已有研究分别报道了 e2 适配体修饰金电极传感器和 p4 无标记阻抗适配体传感器，为两种靶标的适配体识别提供了序列和界面基础。此外，e2或雌激素检测中还可见光电化学酶辅助放大和自供能夹心型适配体方案，p4 检测中亦有电化学发光信号增强和核酸外切酶循环放大方案。这些方案可获得较低检出限，但往往需要第二探针、酶循环、置换反应、光电极或复杂微纳加工；部分生物流体验证还需百倍或千倍稀释、过滤、离心等预处理。已有可穿戴适配体纳米生物传感器展示了女性激素无创监测潜力，但其器件形态、样本体系和本研究的纸基血清检测不同。已有空间分辨三通道光燃料电池能够同时检测皮质醇和p4，但其目标组合、光电转换结构与本研究不同。已有柔性微锥免疫传感器可在同一研究中检测 e2和 p4，但采用抗体识别及复杂三维电极，且唾液样品需离心和高倍稀释。总体而言，在单一低成本纸基器件上，以两个独立适配体通道覆盖e2 和 p4 不同浓度窗口，并直接用于未稀释血清的技术仍不充分。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种可同时检测雌二醇e2和孕酮p4的双通道纸基微流控电化学适配体传感平台及检测方法。

2、本发明不是单纯追求最低检出限，而是在检测性能、器件成本、制造重复性、样品用量和操作复杂度之间取得适于分散式检测的平衡。为此，本发明在一张层压纸基器件内形成两个物理分离但可由同一进样口供样的检测区，使每个检测区配置独立工作电极、对电极和参比电极，并分别构建 e2 和 p4 适配体识别界面。使用者一次加入少量样品，经毛细输运和靶标孵育后，即可获得两个相互独立的电化学响应。

3、本发明以纸张的毛细作用实现无外加泵的样品输运，以功能化碳纳米材料、氧化还原活性分子和金纳米颗粒构成复合电活性界面，以巯基化适配体构成分子识别层，通过差分脉冲伏安法（dpv）读取靶标结合引起的电流降低，从而在同一器件和同一检测流程内获得两种激素的独立定量结果。本发明还涉及所述平台的制备方法、双激素检测方法、配套试剂盒以及与便携式双通道电化学读出装置组成的检测系统。

4、本发明所称“同时检测”，是指同一份样品经一次加样后，在同一纸基器件的两个检测区分别完成e2和p4识别，并在一个检测流程中形成两个可区分的定量结果；电信号可以由双通道设备并行采集，也可以由单台电化学工作站依次连接两个通道顺序采集。本发明不将“严格同一时刻采样”作为实现技术方案的必要条件。

5、根据本发明第一方面，一种双通道纸基微流控电化学适配体传感平台，用于同时检测样品中的雌二醇和孕酮，包括：

6、用于导入样品且具有样品加载区的样本导入层；

7、接触所述样品导入层的辅助电极功能层；

8、接触所述辅助电极功能层的工作电极功能层；

9、所述辅助电极功能层设有用于检测雌二醇的第一电化学检测区、用于检测孕酮的第二电化学检测区以及连通所述第一电化学检测区和第二电化学检测区的样品分流导流区，所述样品分流导流区与所述样本导入层的样品加载区相接触；

10、所述工作电极功能层设有位于所述第一电化学检测区的第一工作电极和位于所述第二电化学检测区的第二工作电极；

11、所述第一工作电极表面固定有雌二醇特异性巯基化适配体；

12、所述第二工作电极表面固定有孕酮特异性巯基化适配体。

13、优选地，所述第一工作电极表面依次层叠有第一复合电活性界面以及雌二醇特异性巯基化适配体；所述第二工作电极表面依次层叠有第二复合电活性界面以及孕酮特异性巯基化适配体。

14、优选地，所述第一复合电活性界面包含第一碳纳米材料、第一氧化还原活性分子和第一金纳米颗粒，所述第一氧化还原活性分子通过π-π作用负载于所述第一碳纳米材料表面，所述第一金纳米颗粒提供所述雌二醇特异性巯基化适配体的au-s锚定位点；所述第二复合电活性界面分别包含第二碳纳米材料、第二氧化还原活性分子和第二金纳米颗粒，所述第二氧化还原活性分子通过π-π作用负载于所述第二碳纳米材料表面，所述第二金纳米颗粒提供所述孕酮特异性巯基化适配体的au-s锚定位点。

15、优选地，所述雌二醇特异性巯基化适配体在 5′ 端通过 5′-sh-(ch2)6 修饰并通过 au–s 作用固定在第一金纳米颗粒上；所述孕酮特异性巯基化适配体在 5′ 端通过 5′-sh-(ch2)6 修饰并通过 au–s 作用固定在第二金纳米颗粒上。

16、优选地，所述辅助电极功能层还设有对称地布置在所述第一电化学检测区上第一参比电极和第一对电极；以及对称地布置在所述第二电化学检测区上第二参比电极和第二对电极。

17、优选地，所述第一碳纳米材料和第二碳纳米材料为二乙烯三胺功能化氧化石墨烯（deta-go），所述第一氧化还原活性分子和第二氧化还原活性分子为新亚甲基蓝（nmb）。

18、优选地，所述雌二醇特异性巯基化适配体在所述第一工作电极上的固定浓度在0.9至1.1μm之间，所述孕酮特异性巯基化适配体在所述第二工作电极上的固定浓度在1.4至1.6μm之间。

19、优选地，所述样本导入层、辅助电极功能层和工作电极功能层均为纤维素纸层；所述样本导入层、辅助电极功能层和工作电极功能层通过层压形成所述纸基微流控芯片。

20、优选地，所述deta-go的分散液浓度为1.0 mg ml-1，所述nmb的浓度为2.0 mg ml-1，所述deta-go/nmb与所述金纳米颗粒的体积比为1:4。

21、优选地，所述雌二醇特异性巯基化适配体具有seq id no.1所示的核苷酸序列，所述孕酮特异性巯基化适配体具有seq id no.2所示的核苷酸序列。

22、优选地，用6-巯基-1-己醇（mch）分别封闭所述雌二醇特异性巯基化适配体和孕酮特异性巯基化适配体，以减小血清蛋白和非靶标分子在金表面的非特异吸附。

23、优选地，本发明通过在所述样品导入层蜡印后形成疏水阻隔区和亲水区，所述亲水区包括连通的样品导入通道和样品加载区。

24、优选地，本发明通过在辅助电极功能层进行蜡印后形成疏水区和亲水区，所述亲水区包括连通的第一电化学检测区、第二电化学检测区和样品分流导流区；通过在辅助电极功能层上印刷电极，形成伸入到第一电化学检测区的第一参比电极以及第一对电极、伸入到到第二电化学检测区的第二参比电极以及第二对电极。

25、根据本发明第二方面，一种采用权利要求1所述平台同时检测雌二醇和孕酮的方法，其特征在于，包括：

26、向样本导入层的样品加载区加入待测样品，使样品在毛细作用下分流至所述第一电化学检测区和第二电化学检测区，以便样品与所述第一工作电极上的雌二醇特异性适配体和所述第二工作电极上的孕酮特异性适配体孵育；

27、孵育后冲洗电极表面,然后通过差分脉冲伏安法dpv读取靶标结合引起的电流降低，从而确定样品中雌二醇和孕酮的浓度。

28、根据本发明第三方面，一种用于雌二醇和孕酮同时检测的试剂盒，包括：

29、双通道纸基微流控电化学适配体传感平台；

30、雌二醇系列校准品和孕酮系列校准品；

31、洗涤液；以及

32、记载有dpv检测参数和标定曲线使用方法的说明书。

33、本发明至少解决以下技术问题：

34、其一，如何在不使用外置泵的情况下，将同一样品可靠输送至两个检测区，并降低通道间液路和电信号串扰；

35、其二，如何在丝网印刷碳工作电极上形成既能提供稳定电活性信号、又能固定巯基适配体的复合界面；

36、其三，如何针对e2和p4不同的生理浓度尺度分别配置适配体探针密度和标定窗口，使同一器件能够兼容两种浓度尺度明显不同的激素检测；

37、其四，如何将小分子与适配体结合这一难以直接测量的事件转换为无需额外标记的电流变化；

38、其五，如何降低甾体类似物和血清基质导致的非特异响应，使平台能够在未稀释血清中实现可靠定量；

39、其六，如何使批内、批间和储存后的响应保持可接受的一致性，为产品化提供工艺基础。

40、本发明提供了一种结构简单、样品消耗低、无需外加泵、两个通道可独立标定且能够在复杂基质中工作的双激素平台，并且解决与本发明最接近的现有技术存在的以下技术问题：单靶标装置不能提供协调的 e2/p4 信息；多步放大体系制造和操作复杂；两个通道若共用电极或反应区，容易产生识别和电信号串扰；一般纸基装置缺少兼具稳定内置氧化还原信号、巯基探针锚定位点和抗基质能力的界面；缓冲液中获得的高灵敏度也未必能转化为未稀释临床血清中的可靠定量。