一种纳米抗亲和介质的制备方法及其在乙肝表面抗原纯化中的应用与流程

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种纳米抗亲和介质的制备方法及其在乙肝表面抗原纯化中的应用。

背景技术：

1、乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒引起的严重肝脏类疾病，可能引发慢性感染、肝硬化及肝癌，对全球公共卫生构成重大威胁。重组乙肝表面抗原不仅是乙肝疫苗的重要组成，也是乙肝病毒感染检测的重要试剂原料。然而，重组乙肝表面抗原的聚集与自组装特性增加了纯化制备难度。传统多步色谱法，如免疫亲和、疏水、离子交换、凝胶过滤等流程复杂、收率低、成本高，可能影响其结构完整性；高成本、低寿命的超速离心设备也不适合工业化生产。因此，开发高效、稳定且适用于规模化的亲和纯化策略，成为工艺优化的关键。基于传统单克隆抗体的免疫亲和层析具备较高特异性，但单克隆抗体分子量大，稳定性差，生成周期长，制备成本高；且单克隆抗体对碱性环境及变性剂不耐受，限制了填料的再生和清洗操作。这些因素限制了单克隆为配基的亲和填料的广泛应用。

2、因此，亟需开发兼具高特异性、温和洗脱、稳定循环性能的新型亲和介质，既可简化流程、提高回收率，又能保持乙肝表面抗原结构与活性，满足大规模生产需求的亲和填料，并建立一种操作简便、纯化率高、成本低、耗时短，可应用于工业化大规模生产的乙肝表面抗原的分离纯化方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种纳米抗亲和介质的制备方法及其在乙肝表面抗原纯化中的应用，以纳米抗工程菌作为偶联填料与亲和层析介质偶联，可得到高纯度及高回收率的目标蛋白，乙肝表面抗原的纯度达到90%以上。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

3、一种纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、s1、构建表达纳米抗体的工程菌，对菌种进行低温诱导表达；

5、s2、收集菌体，破碎菌体后离心并分离上清，从上清中纯化获得纳米抗体；

6、s3、将纳米抗体与层析介质进行偶联反应，得到纳米抗亲和介质。

7、优选地，前述纳米抗亲和介质的氨基酸序列如seq id no.1所示。

8、优选地，前述步骤s1中，构建表达纳米抗体的工程菌的具体步骤为：

9、（1）设计引物序列，合成目的基因的上下游引物，扩增目的基因；

10、（2）将获得的目的基因片段与酶切后的质粒载体通过连接酶相连，再将连接产物转化成感受态细胞后培养，挑取单菌落再接种培养，得到表达纳米抗体的工程菌。

11、优选地，前述步骤s1中，菌种诱导表达的具体步骤为：

12、（1）选取测序正确的单菌落接种培养后诱导，得到诱导全菌液；

13、（2）将全菌液进行离心，得到菌泥；

14、（3） 将重悬缓冲液加入菌泥，充分重悬后破碎，离心后收集上清。

15、优选地，前述步骤（3）中，重悬缓冲液为50mm tris，ph7.5，菌体重量体积比1：10-15。

16、优选地，前述步骤（2）中，离心上清采用金属螯合介质进行纯化，洗脱咪唑浓度0.5-1.0 m。

17、优选地，前述步骤s3中，偶联反应包括以下步骤：

18、（1）取环氧活化的介质微球，用纯化水多次重悬抽干，再用偶联缓冲液置换抽干；

19、（2）将纯化后的纳米抗体置换至偶联缓冲液中并浓缩；

20、（3）将清洗后的介质微球与浓缩后的纳米抗体混合，反应；

21、（4）反应后加入乙醇胺溶液封闭，清洗抽干，得到纳米抗亲和介质偶联物。

22、优选地，前述步骤（1）中，介质微球为琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或纤维素微球中的一种，偶联缓冲液包括0.1-0.5m nahco3和0.2-0.7m nacl，ph 8-9；所述步骤（2）中，纳米抗体浓缩后的浓度为1.5-2.5 mg/ml；所述步骤（3）中，清洗后的介质微球与浓缩后的纳米抗体的体积比为1：（0.8-1.5），反应温度20-40℃，时间14-20h。

23、纳米抗亲和介质在乙肝表面抗原纯化中的应用，用于在乙肝表面抗原的纯化中作为层析介质。

24、一种乙肝表面抗原的纯化方法，包括以下步骤：

25、（1）将上述的纳米抗亲和介质偶联物装入层析柱，用缓冲液过柱平衡；

26、（2）将含有乙肝表面抗原的样品上样至平衡后的层析柱中，用淋洗缓冲液洗涤层析柱至基线；

27、（3）用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，得到纯化的乙肝表面抗原。

28、优选地，前述步骤（2）中，含有乙肝表面抗原的样品上样前先调节ph至7-8；步骤（3）中，洗脱缓冲液为ph 1-3的柠檬酸缓冲液。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果：

30、（1）本发明以纳米抗工程菌作为偶联填料与亲和层析介质偶联，可得到高纯度及高回收率的目标蛋白，乙肝表面抗原的纯度达到90%以上；

31、（2）在高流速下，纳米抗亲和介质的动态载量及蛋白结合量高，能够更好地吸附和纯化乙肝表面抗原，可以满足大批量纯化蛋白的需求；纳米抗亲和介质制备工艺简单、造价低、介质易再生、批次重复性较好，极大地降低了乙肝表面抗原的纯化成本；（3）纳米抗亲和介质配基选择简单且稳定性高，应用于亲和层析分离纯化蛋白可以保证乙肝表面抗原的活性及结构完整性，同时具有纯化条件温和、特异性高、选择性及通用性较好。

1.一种纳米抗亲和介质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米抗亲和介质的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，构建表达纳米抗体的工程菌的具体步骤为：

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，菌种诱导表达的具体步骤为：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，离心上清采用金属螯合介质进行纯化，洗脱咪唑浓度0.5-1.0 m；步骤（3）中，重悬缓冲液为50mm tris，ph7.5，菌泥及重悬缓冲液重量体积比为1：10-15。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤s3中，偶联反应包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，介质微球为琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或纤维素微球中的一种，偶联缓冲液包括0.1-0.5mnahco3和0.2-0.7m nacl，ph 8-9；所述步骤（2）中，纳米抗体浓缩后的浓度为1.5-2.5 mg/ml；所述步骤（3）中，清洗后的介质微球与浓缩后的纳米抗体的体积比为1：（0.8-1.5），反应温度20-40℃，时间14-20h。

8.采用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的纳米抗亲和介质在乙肝表面抗原纯化中的应用。

9.一种乙肝表面抗原的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的乙肝表面抗原的纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）中，含有乙肝表面抗原的样品上样前先调节ph至7-8；所述步骤（3）中，洗脱缓冲液为ph 1-3的柠檬酸缓冲液。