一种基于酵母脂质提取物的脂质组学验证方法及试剂盒

本发明涉及脂质组学领域，具体涉及一种基于酵母脂质提取物的脂质组学验证方法及试剂盒。

背景技术：

1、脂质组学是对生物样品中脂质的种类、组成及变化进行分析的技术。液相色谱-串联质谱能够结合色谱分离与质谱检测，广泛应用于磷脂、甘油酯等脂质的分析。其中，多反应监测模式通过选择特定的前体离子及其裂解形成的产物离子建立监测离子对，并结合色谱峰的保留时间，对目标脂质进行识别。

2、在相关检测方法中，通常依据脂质标准品、质谱碎裂规律及保留时间信息设置监测离子对并进行脂质注释。然而，生物样品中的脂质结构复杂，不同脂质可能具有相同或接近的前体离子质荷比，部分脂质还可产生相同的特征产物离子。因此，检测到预设监测通道的色谱峰，并不必然表明该色谱峰对应于预期的目标脂质，仍需对监测离子对及保留时间归属进行验证。

3、当标准品未覆盖待测脂质时，仅依据预设离子对及保留时间信息，难以获得充分的结构对应依据，可能出现脂质归属错误。此外，在缺少具有明确脂质组成差异的参照材料时，也难以通过样品组成变化核查脂质亚类及甘油酯的定性结果。因此，需要提供适于脂质组学检测方法验证的材料及相应验证方法，以提高脂质定性结果的可靠性。

技术实现思路

1、本发明旨在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种基于酵母脂质提取物的脂质组学验证方法及试剂盒，具有提高脂质定性结果可靠性的优点。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种基于酵母脂质提取物的脂质组学验证方法，包括：获取同位素标记酵母脂质提取物，所述同位素标记酵母脂质提取物含有目标标记脂质，所述目标标记脂质由同位素标记前体经酵母内源脂质合成代谢掺入目标脂质形成；

4、获取待验证的脂质组学检测方法中为所述目标脂质设定的第一多反应监测离子对m→m，并根据所述目标标记脂质所含同位素原子的数量及其在质谱裂解过程中所处的结构片段，确定所述目标标记脂质对应的第二多反应监测离子对（m+δm）→(m+δm），其中，δm为预设前体离子质荷比偏移量，δm为预设产物离子质荷比偏移量；

5、将所述同位素标记酵母脂质提取物与含有所述目标脂质的待测样品混合，得到验证样品；

6、按照所述待验证的脂质组学检测方法的色谱条件和质谱条件，对所述验证样品进行液相色谱-串联质谱检测，分别采集所述第一多反应监测离子对和所述第二多反应监测离子对，得到第一色谱峰和第二色谱峰；

7、确定所述第一色谱峰与所述第二色谱峰之间的保留时间差，在所述第二多反应监测离子对下检测到所述第二色谱峰，且所述保留时间差满足预设保留时间阈值的情况下，根据所述第二多反应监测离子对相对于所述第一多反应监测离子对所具有的前体离子质荷比偏移量δm和产物离子质荷比偏移量δm，确定所述第一多反应监测离子对的脂质归属和所述第一色谱峰的保留时间归属正确。

8、在本技术中，同位素标记前体经酵母内源脂质合成代谢掺入目标脂质后，所得目标标记脂质与对应未标记脂质具有相近的色谱保留行为，同时在前体离子和相应产物离子上形成可预期的质荷比偏移。通过在相同色谱和质谱条件下采集未标记脂质与目标标记脂质对应的多反应监测离子对，并结合标记色谱峰的检出情况、保留时间差以及前体离子和产物离子的质荷比偏移进行联合判定，可以从色谱行为和质谱裂解行为两个方面相互验证，降低等质量脂质、同分异构脂质、共洗脱物质或非特异性碎片造成脂质误归属的可能性，提高多反应监测离子对的脂质归属及色谱峰保留时间归属的准确性和可靠性。

9、可选的，所述预设保留时间阈值不大于0.1 min；所述脂质组学验证方法还包括：确定所述第二色谱峰的峰面积与所述第一色谱峰的峰面积之比，并将所得峰面积比与根据所述同位素标记前体的掺入率、所述同位素标记酵母脂质提取物的加入量以及所述目标脂质在相同检测条件下的响应确定的预期峰面积比范围进行比较。

10、可选的，所述同位素标记前体包括下列至少一种：

11、用于标记磷脂酰胆碱和/或溶血磷脂酰胆碱的d9-胆碱；

12、用于标记磷脂酰乙醇胺和/或溶血磷脂酰乙醇胺的d4-乙醇胺；

13、用于标记磷脂酰丝氨酸的d3-丝氨酸；以及

14、用于标记磷脂酰肌醇的13c6-肌醇。

15、可选的，所述同位素标记前体为d9-胆碱，所述目标脂质为磷脂酰胆碱，所述d9-胆碱经酵母内源脂质合成代谢掺入所述磷脂酰胆碱的胆碱头基；在正离子检测模式且所述目标脂质和目标标记脂质均为单电荷离子的情况下，所述第一多反应监测离子对的产物离子质荷比为m/z 184，所述第二多反应监测离子对的产物离子质荷比为m/z 193，所述第二多反应监测离子对的前体离子质荷比相对于所述第一多反应监测离子对的前体离子质荷比增加9。

16、可选的，所述同位素标记前体为13c16-棕榈酸，所述目标脂质为在负离子检测模式下能够产生棕榈酸羧酸根产物离子的含棕榈酰基脂质，所述13c16-棕榈酸经酵母内源脂质合成代谢掺入所述目标脂质的脂肪酰基链；在所述前体离子和产物离子均为单电荷离子的情况下，未标记棕榈酰基对应的产物离子质荷比为m/z 255，13c16标记棕榈酰基对应的产物离子质荷比为m/z 271，并且每掺入一个所述13c16标记棕榈酰基，所述目标标记脂质的前体离子质荷比相对于所述目标脂质的前体离子质荷比增加16。

17、可选的，所述同位素标记酵母脂质提取物包括分别制备的d9-胆碱单标记酵母脂质提取物和13c16-棕榈酸单标记酵母脂质提取物；或者，所述同位素标记酵母脂质提取物为通过在同一酵母培养体系中加入d9-胆碱和13c16-棕榈酸制得的双标记酵母脂质提取物，所述双标记酵母脂质提取物含有胆碱头基掺入d9-胆碱且脂肪酰基链掺入13c16-棕榈酸的磷脂酰胆碱，以根据胆碱头基和脂肪酰基链分别产生的质荷比偏移验证所述磷脂酰胆碱的头基归属和脂肪酰基链归属。

18、可选的，所述同位素标记前体为13c3-甘油，所述目标脂质为甘油二酯和/或甘油三酯，所述13c3-甘油经酵母内源脂质合成代谢掺入所述目标脂质的甘油骨架，在所述目标脂质和所述目标标记脂质的前体离子均为单电荷离子的情况下，所述目标标记脂质的前体离子质荷比相对于所述目标脂质的前体离子质荷比增加3；在所述目标标记脂质的产物离子保留所述甘油骨架且为单电荷离子的情况下，所述产物离子质荷比相对于对应未标记产物离子的质荷比增加3。

19、此外，本发明还提供了一种用于脂质组学检测方法验证的试剂盒，包括分别包装的至少一种同位素标记酵母脂质提取物、野生型酵母脂质提取物以及至少一种脂质组成调控型工程酵母脂质提取物；

20、所述同位素标记酵母脂质提取物含有由同位素标记前体经酵母内源脂质合成代谢形成的目标标记脂质，所述目标标记脂质相对于对应的未标记脂质具有预设前体离子质荷比偏移量和预设产物离子质荷比偏移量，以用于验证多反应监测离子对的脂质归属和/或色谱峰的保留时间归属；

21、所述野生型酵母脂质提取物由用于构建所述脂质组成调控型工程酵母的出发菌株制得，所述脂质组成调控型工程酵母脂质提取物与所述野生型酵母脂质提取物在脂质种类和/或脂质相对含量方面具有预期差异，以用于验证脂质亚类和/或甘油酯的定性结果。

22、在本技术中，试剂盒通过分别设置同位素标记酵母脂质提取物、野生型酵母脂质提取物和脂质组成调控型工程酵母脂质提取物，既能够利用同位素标记脂质的预设质荷比偏移和保留时间对应关系验证离子对及保留时间归属，又能够利用工程酵母与其出发菌株之间的预期脂质组成差异验证脂质亚类和甘油酯的定性结果，从而为脂质组学检测方法提供不同层面的标准化验证材料，提高验证结果的完整性和重复性。

23、可选的，用于制备所述脂质组成调控型工程酵母脂质提取物的工程酵母包括下列至少一种：过表达ole1基因的酵母、敲除或抑制cds1基因表达的酵母、敲除cho1基因的酵母、敲除opi3基因的酵母、敲除dga1基因和lro1基因的酵母以及过表达plb1基因的酵母。

24、可选的，所述同位素标记酵母脂质提取物包括d9-胆碱单标记酵母脂质提取物、13c16-棕榈酸单标记酵母脂质提取物、13c3-甘油单标记酵母脂质提取物以及由d9-胆碱和13c16-棕榈酸在同一酵母培养体系中进行标记所得的双标记酵母脂质提取物中的至少一种；所述双标记酵母脂质提取物含有胆碱头基掺入d9-胆碱且脂肪酰基链掺入13c16-棕榈酸的同一磷脂酰胆碱分子。

25、本发明的这些特点和优点将会在下面的具体实施方式以及附图中进行详细的揭露。本发明最佳的实施方式或手段将结合附图来详尽表现，但并非是对本发明技术方案的限制。另外，在每个下文和附图中出现的这些特征、要素和组件是具有多个，并且为了表示方便而标记了不同的符号或数字，但均表示相同或相似构造或功能的部件。