一种组织样本中细胞死亡类型的区分染色方法及试剂盒与流程

本发明涉及荧光检测，特别涉及一种组织样本中细胞死亡类型的区分染色方法及试剂盒。

背景技术：

1、脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应综合征（sirs），其特征是机体对感染的反应失调，导致危及生命的器官功能障碍。脓毒症的发病机制复杂，涉及多种炎症介质的过度释放，如肿瘤坏死因子（tnf）、白细胞介素（il）-6和il-1β等。这些炎症介质在感染初期引发强烈的促炎反应，随后可能转变为抗炎反应，导致免疫抑制。

2、目前脓毒症免疫评估主要是对唾液、尿液、血液等体液中炎症因子进行检测，但对感染造成的组织损伤尚无检测方案，近几年研究对于脓毒症免疫微环境，越来越多的关注，而对于组织细胞死亡类型的区分，还存在单种细胞类型的检测局限。在生物医学研究和临床诊断中，组织细胞的死亡状态检测是一个关键环节。细胞死亡方式主要包括凋亡、坏死、焦亡和自噬等，每种死亡方式都有其独特的生物学意义和病理学特征。准确区分这些细胞死亡方式对于理解疾病发生机制、评估治疗效果以及开发新型药物具有重要意义。然而，目前现有的检测方法大多存在局限性，例如特异性不足、灵敏度较低或操作复杂等问题。例如，传统的ldh释放实验虽然可以检测细胞膜完整性丧失，但无法区分细胞死亡的具体类型；而免疫组化方法虽然具有较高的特异性，但通常需要复杂的样本处理和较长的实验周期。

3、近年来，荧光检测技术因其高灵敏度、高特异性和快速检测的特点，在生物医学领域得到了广泛应用。荧光标记技术可以实时监测细胞内的生理和病理变化，为细胞死亡检测提供了新的思路。然而，目前尚未有专门针对组织死亡细胞的荧光区分染色方法和试剂盒，能够同时满足高特异性、高灵敏度和快速检测的需求。

4、因此，现有技术仍有待改进和发展。

技术实现思路

1、鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于一种提供组织样本中细胞死亡类型的区分染色方法及试剂盒，旨在为组织死亡细胞的区分检测提供一种新策略。

2、本发明的技术方案如下：

3、第一方面，提供一种组织样本中细胞死亡类型的区分染色方法，包括步骤：染色；

4、所述染色步骤，包括：按照如下抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的肺组织样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：

5、抗原顺序依次为：caspase-1、ldh-b、cd68、gasdermin d、caspase-3、cleavedparp；

6、所述染色步骤中，抗原对应的一抗与染色剂依次配对如下：

7、caspase-1的一抗配对的染色剂为if440-tyramide，ldh-b的一抗配对的染色剂为if488-tyramide，cd68的一抗配对的染色剂为if546-tyramide，gasdermin d的一抗配对的染色剂为if594-tyramide，caspase-3的一抗配对的染色剂为if647-tyramide，cleavedparp的一抗配对的染色剂为if750-tyramide。

8、优选的技术方案，所述染色步骤中，包括：按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。

9、进一步优选的技术方案，所述染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。

10、优选的技术方案，所述染色步骤中，对6种抗原完成染色后，还包括：使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。

11、进一步优选的技术方案，所述核染色剂包括：dapi。

12、优选的技术方案，还包括步骤：成像；

13、所述成像步骤，包括：对染色后的样本进行连续光谱成像，获得对应的染色图像。

14、进一步优选的技术方案，还包括步骤：非诊断治疗目的的检测；

15、所述检测步骤，包括：对染色图像进行检测，获得检测结果。

16、第二方面，提供一种用于组织样本的试剂盒，包括：一抗和染色剂；

17、所述一抗包括：caspase-1的一抗、ldh-b的一抗、cd68的一抗、gasdermin d的一抗、caspase-3的一抗、cleaved parp的一抗；

18、所述染色剂包括：if440-tyramide、if488-tyramide、if546-tyramide、if594-tyramide、if647-tyramide、if750-tyramide；

19、所述一抗与染色剂的配对关系如下：

20、caspase-1的一抗配对的染色剂为if440-tyramide，ldh-b的一抗配对的染色剂为if488-tyramide，cd68的一抗配对的染色剂为if546-tyramide，gasdermin d的一抗配对的染色剂为if594-tyramide，caspase-3的一抗配对的染色剂为if647-tyramide，cleavedparp的一抗配对的染色剂为if750-tyramide。

21、优选的技术方案，还包括：核染色剂；所述核染色剂为dapi。

22、优选的技术方案，还包括：抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。

23、与现有技术相比，本发明的优势包括：

24、（1）本发明提供的组织样本中细胞死亡类型的区分染色方法及试剂盒，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，大大提高单张组织样本的利用率，尤其是珍贵样本。

25、（2）能够节约病人取材的样本，便于样本有足够的量做其他检测项目。

26、（3）实现标准化操作，有效解决脓毒症免疫研究问题；同时也可以用于其他需要进行多细胞死亡类型区分的研究需求。

27、（4）降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可以满足要求，同时避免了微小组织样本染色重复性差的问题。

1.一种组织样本中细胞死亡类型的区分染色方法，其特征在于，包括步骤：染色；

2.根据权利要求1所述的区分染色方法，其特征在于，所述染色步骤中，包括：按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。

3.根据权利要求2所述的区分染色方法，其特征在于，所述染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。

4.根据权利要求1所述的区分染色方法，其特征在于，所述染色步骤中，对6种抗原完成染色后，还包括：使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。

5.根据权利要求4所述的区分染色方法，其特征在于，所述核染色剂包括：dapi。

6.根据权利要求1所述的区分染色方法，其特征在于，还包括步骤：成像；

7.根据权利要求6所述的区分染色方法，其特征在于，还包括步骤：非诊断治疗目的的检测；

8.一种用于组织样本的试剂盒，其特征在于，包括：一抗和染色剂；

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括：核染色剂；所述核染色剂为dapi。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括：抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。