一种pH/Mg2+响应控释型氢-褪黑素复合制剂及其在菊花逆境胁迫缓解中的应用

本发明属于植物栽培，具体涉及一种ph/mg2+响应控释型氢-褪黑素复合制剂及其在菊花逆境胁迫缓解中的应用。

背景技术：

1、菊花是一种药用价值高、活性成分丰富的菊科药用作物，其生长过程中对环境条件敏感，易受高温、干旱、强光等胁迫影响，黄酮类、绿原酸等活性成分的合成与积累直接受环境胁迫调控，同时土壤微生态的稳定性直接决定菊花的产量和品质。富氢水浇灌是近年来新兴的菊花栽培辅助技术，氢气作为一种新型抗氧化剂，可有效清除菊花植株体内的活性氧，增强植株抗逆性，促进花芽分化和活性成分积累。但现有富氢水浇灌技术存在明显弊端：一方面，氢气分子极小、极易挥发，富氢水制成后无法长期保持高浓度，存放数小时后氢气浓度急剧下降，浇灌时“富氢”效力大打折扣，甚至与普通水无异；另一方面，长期高浓度富氢水浇灌会改变土壤中微生物的自然平衡，影响土壤肥力结构，同时可能削弱菊花自身的防御机制，导致其对环境变化的适应能力下降。

2、褪黑素（melatonin，mt）是一种广泛存在于植物体内的吲哚胺类小分子，在植物中由色氨酸经色胺、5-羟色胺、n-乙酰-5-羟色胺四步酶促反应合成，其中血清素n-乙酰转移酶（snat）为限速酶。近年来研究表明，外源mt可有效缓解菊花多种逆境胁迫：研究发现叶面喷施mt可显著降低高温胁迫下菊花幼苗mda积累和h2o2含量，提高sod、pod、cat、apx等抗氧化酶活性，促进脯氨酸和可溶性蛋白等渗透调节物质合成。

3、然而，外源mt在田间应用中面临严峻挑战：mt属于两亲性小分子，在紫外线下极易光降解，在土壤中易被微生物代谢或随水分淋溶流失，传统叶面喷施方式需反复施用且受降雨影响大，利用效率低下；同时，植物自身合成的mt浓度往往不足以应对重度胁迫，而高浓度外源补充又因上述降解问题难以维持有效浓度。此外，现有mt缓释制剂（如壳聚糖微粒、β-环糊精纳米海绵等）虽可在一定程度上延缓mt释放，但功能单一，仅解决mt的递送问题，未能将mt与其他抗逆信号分子（如h2）协同整合，无法发挥信号级联放大的抗逆效果。

4、为解决上述问题，研发一种安全性高、释氢稳定、可基于根区微环境（ph、mg2+浓度、湿度）自适应调控释氢速率，且能同步缓释褪黑素以发挥h2-mt信号级联协同抗逆效应，同时工艺简单、成本可控的复合制剂，及其适配菊花逆境胁迫缓解的应用方法，成为当前亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、要解决的技术问题：针对现有富氢水浇灌技术氢气极易衰减、固态氢制剂释氢速率无法自适应调控且易导致土壤ph异常升高、褪黑素田间施用易光降解和淋溶流失、以及现有技术尚未将h2供体与褪黑素整合为信号级联协同体系的技术问题，本发明的目的是提供一种ph/mg2+响应控释型氢-褪黑素复合制剂及其在菊花逆境胁迫缓解中的应用，构建h2-mt信号级联协同抗逆体系，内源mt诱导与外源mt补充双通道协同，抗逆效果显著超越单独施用h2或mt；实现ph/mg2+/湿度三因子自适应释氢调控，释氢速率与植物生理需氢节奏自然同步。

2、技术方案：一种ph/mg2+响应控释型氢-褪黑素复合制剂，所述复合制剂由固态氢制剂双层包覆颗粒、γ-pga/褪黑素复合控释材料和生物相容性粘结剂按质量比3~5:1:0.1~0.2混合，经低压压片工艺制成直径2~3mm的一体化颗粒。

3、进一步的，所述固态氢制剂双层包覆颗粒的制备步骤为：

4、（1）原料预处理：将氢化镁微粉在无水、无氧、氮气保护条件下，球磨至粒径1~5μm；硅藻土干燥至水分含量≤0.5%；

5、（2）粉体混合：在氮气氛围下，先将30~38份氢化镁微粉与15~22份磷酸二氢钾混合8~10min，再依次加入15~25份硅藻土、10~18份缓释调节剂、5~10份粘结剂，在转速50~80r/min下混合25~30min，得到复合粉体；

6、（3）干法造粒：采用辊压干法造粒工艺，制成0.5~2mm的初颗粒；

7、（4）低温烘干：40~45℃真空干燥2h，氮气氛围下，冷却至室温；

8、（5）双层梯度包覆：采用流化床包衣技术，先以乙基纤维素乙醇溶液作为内层疏水性包覆液，包覆厚度50~100μm；再以壳聚糖稀醋酸溶液作为外层亲水性包覆液，包覆厚度30~50μm；壳聚糖外层兼具亲水性和ph响应收缩特性，得到固态氢制剂双层包覆颗粒。

9、进一步的，步骤（2）中所述缓释调节剂为硬脂酸与棕榈酸的混合物；所述粘结剂为羟丙基甲基纤维素。

10、进一步的，所述硬脂酸与棕榈酸的质量比为1:1。

11、进一步的，步骤（5）中所述乙基纤维素乙醇溶液的质量分数为5~8%；所述壳聚糖稀醋酸溶液的质量分数为3~5%。

12、进一步的，所述γ-pga（聚谷氨酸）/褪黑素复合控释材料的制备方法如下：

13、s1.将褪黑素溶于无水乙醇，配制浓度为100~200 μmol/l的褪黑素乙醇溶液；

14、s2.将γ-pga粉末浸渍于褪黑素乙醇溶液中，搅拌30min；

15、s3.30~35℃真空干燥6-7h，使乙醇完全挥发，褪黑素均匀分散并物理嵌入γ-pga基质中；

16、s4.研磨过100目筛，得到γ-pga/褪黑素复合控释材料粉末。

17、进一步的，s2中所述褪黑素乙醇溶液与γ-pga的液料比为40~60 ml/g。

18、进一步的，所述生物相容性粘结剂为明胶。

19、本发明还提供了上述ph/mg2+响应控释型氢-褪黑素复合制剂在菊花逆境胁迫缓解中的应用。

20、进一步的，应用方法如下：

21、1、施用时机：菊花定植后至现蕾期，每隔7~10天施用一次；菊花花期、高温强光胁迫期，缩短至每隔5~7天施用一次；

22、2、施用方式：在菊花植株根部周围5~8cm处开挖深度5~10cm的浅沟，将颗粒均匀撒入，覆盖土壤压实；

23、3、施用量：每株菊花每次施用2~3g；

24、4、ph监测与调整：定期使用便携式ph计检测根区土壤ph，当土壤ph>8.0时减少施用量或暂停施用，待土壤ph恢复至6.0~7.0后再继续施用。

25、有益效果

26、1、本发明首次将固态h2供体与外源mt整合为协同体系，构建内源mt诱导和外源mt补充双通道褪黑素供给。h2作为上游信号分子上调snat基因表达（表11：snat表达提升225%），促进内源mt合成（内源mt提升266.4%），低剂量持续外源mt缓释补充弥补重度胁迫下内源mt合成瓶颈，两者协同叠加显著放大抗逆效果。高温胁迫下pn提升124.5%、mda降低67.9%、sod提升96.7%，显著优于单独施用富氢水或mt。

27、2、本发明通过双层梯度包覆提供基础稳供（14d累计释氢362~398 ml/g）；壳聚糖外层ph响应收缩在碱性条件下自抑制（ph 9.0时释氢降至28%~36%）；γ-pga的mg2+交联提供缓变阻尼（峰值平台期cv<5%）；γ-pga湿度正反馈使释氢与植物蒸腾节奏同步（湿度25%→40%时释氢提升35%~42%）。正反馈与负反馈动态平衡，避免爆释或供氢不足。

28、3、本发明中γ-pga基质为mt提供双重保护：①物理屏蔽阻隔紫外线降低光降解速率；②吸水膨胀-脱水收缩控制mt低剂量持续缓释（28d累计释放率68%~75% ），避免叶面喷施mt需反复施用、易淋溶流失的问题。h2与mt释放受同一湿度响应机制调控，同步指数si达0.92~0.94，实现时间同步和空间协同。

29、4、本发明通过ph负反馈自调节、γ-pga的mg2+缓变阻尼和磷酸二氢钾缓冲体系的三重保障，土壤ph全程维持在6.6~7.1安全区间（表10），无异常升高。硅藻土、包覆材料、γ-pga及粘结剂均可自然降解，无土壤残留。与高浓度富氢水浇灌可能破坏土壤微生态平衡相比，本发明对土壤友好。

30、5、本发明中硅藻土为惰性填料，其多孔结构的热容缓冲效应和稀释隔离效应，有效降低mgh2粉尘自燃风险；40℃/75%rh加速30d释氢保留率>92%。

31、6、本发明工艺简单：干法造粒+低压压片复合工艺，无需特殊设备，可工业化量产。

32、7、本发明应用便捷：复合颗粒根区埋施即可，无需复杂灌溉设备，可直接融入现有药用菊花栽培体系。