橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。


背景技术：

2.目前已有的抗新冠小分子药物，如瑞德西韦、莫匹拉韦、帕昔洛韦和阿兹夫定等在临床治疗中并未表现出预期的保护效果。
3.决明子是一种常见的中药材，通常用于治疗肝热、目赤、头痛和高血压、高血脂等。其主要成分包括：决明子苷、决明素、决明内酯、决明蒽醌、决明碱等。各种决明子单体活性小分子被报道对多种疾病，如神经退行性疾病、过敏性疾病和乳腺癌具有很好的治疗效果，但尚未有文献报道决明子及其主要活性小分子单体抗sars-cov-2作用。


技术实现要素：

4.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
5.橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
6.可选地，所述的橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，其中，所述新型冠状病毒包括：野生型sars-cov-2wiv-04、delta、omicron ba 1.1、omicron ba 2.2、omicron ba 5.1。
7.可选地，所述的橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，其中，所述橙黄决明素对新型冠状病毒的感染与复制的抑制表现为抑制细胞上清中病毒核酸水平，以及细胞内病毒np蛋白水平。
8.有益效果：本发明相对于现有技术相比具有如下技术效果：
9.(1)本发明中的橙黄决明素是中药材决明子中的有效活性成分之一，被广泛报道用于减肥、护肝等保健用品，本发明首次发现橙黄决明素对sars-cov-2具有高效的抗病毒效果。
10.(2)本发明中的橙黄决明素在动物体内无明显肝肾毒性，长期口服药物(每天1次，连续服药14天)对恒河猴的各项生化指标无明显损伤。
11.(3)本发明中的橙黄决明素在多个细胞模型(vero、小气道上皮细胞和角膜缘上皮细胞)对野生型sars-cov-2和常见突变株具有显著的抑制效果。
附图说明
12.图1是橙黄决明素的结构式，以及在人小气道上皮细胞(hawec-02014)、人角膜缘上皮细胞(hncwc/hl-008)和vero细胞中的细胞毒性结果图；
13.图2是橙黄决明素对野生型sars-cov-2wiv-04在人小气道上皮细胞(hawec-02014)、人角膜缘上皮细胞(hncwc/hl-008)和vero细胞中的抗病毒药效结果图；
14.图3是橙黄决明素对delta株、omicron ba1.1、ba2.2和ba5.1在人小气道上皮细胞(hawec-02014)、人角膜缘上皮细胞(hncwc/hl-008)和vero细胞中的抗病毒药效结果图。
具体实施方式
15.本发明提供一种橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
16.本发明中的橙黄决明素为市售产品，英文名：aurantio-obtusin，cas号为67979-25-3，hplc＝98.7％。
17.所述的橙黄决明素细胞水平溶解条件优选为dmso于室温溶解至20mm，分装后冻存于-20℃冰箱；动物实验的溶解条件优选为2％的吐温80，超声波震荡溶解，每次使用前现配现用。
18.所述的sars-cov-2免疫荧光实验优选条件为sars-cov/sars-cov-2nucleocapsid antibody(hrp),rabbit mab(40143-r004-h)，或goat anti-rabbit igg h&l(alexa488)。
19.所述的人小气道上皮细胞(hawec-02014)和人角膜源上皮细胞(hncwc/hl-008)的培养条件优选为用hl培养基于37℃、5％ co2培养；所述的hl培养基为：dmem与无血清培养基sfm按体积比1:3混合，同时添加5％(v/v)的fbs(胎牛血清)，以及0.4μg/ml皮质醇(hydrocortisone)，5μg/ml胰岛素(insulin)，8.4ng/ml霍乱毒素(choleratoxin)，10ng/ml表皮生长因子(epithelial growth factor(egf))，24μg/ml腺嘌呤(adenine)，100u/ml青霉素(penicillin)，100μg/ml链霉素(streptomycin)，0.25μg/ml两性霉素b(fungizone)，30μm法舒地尔(fasudil)，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
20.所述的vero细胞的培养条件优选为用10％ fbs的dmem培养基于37℃、5％co2培养。
21.下面通过具体的实施例来对本发明所提供的橙黄决明素在制备抗新型冠状病毒药物中的应用做进一步的解释说明。
22.实施例1
23.橙黄决明素在细胞水平中的细胞毒性检测
24.(1)vero、人小气道上皮细胞或人角膜缘上皮细胞以8000/孔铺板至96孔板，24小时后吸掉培养基，每孔加入含有浓度梯度的橙黄决明素的新鲜培养基，继续培养48小时；
25.(2)吸去培养上清后，每孔使用200μl室温平衡后的pbs清洗3次；
26.(3)吸去pbs，每孔加入100μl cck8工作液(cck8与dmem以1:9配置)37℃孵育2h；
27.(4)使用多功能酶标仪(bio-tek)检测od450和od630，经过graphpad prism 6.0软件处理数据后，绘制细胞存活率曲线。如图1所示，在人小气道上皮细胞、人角膜缘上皮细胞和vero细胞中，200μm浓度以下的橙黄决明素无细胞毒性。
28.实施例2
29.(1)实验选用4只年龄、体重相近的健康恒河猴(雌雄各2只)，年龄在3-5周岁，其中实验组a、b各2只猴(确保各实验组均有雌雄猴体)；
30.(2)每天上午10点以实验组a药物浓度为1mg/kg/天/只、实验组b药物浓度为3mg/
kg/天/只口服灌胃进行给药处理，连续给药14天；
31.(3)在实验第1、6、10、15天的上午8点-10点抽取血液并进行生化指标分析(均在给药前取样)；
32.(4)使用生化检测仪检测各实验用猴血清生化指标和尿常规指标。如图下表所示，1mg/kg/天/只和3mg/kg/天/只药物处理对恒河猴无明显肝肾毒性。
33.[0034][0035]
实施例3
[0036]
(1)vero、人小气道上皮细胞或人角膜缘上皮细胞以20000/孔铺板至96孔板，24小时后转移至bsl-3实验室；
[0037]
(2)使用2％ fbs的dmem培养基稀释野生型sars-cov-2wiv-04原液，最终病毒滴度为20000copies/ml；
[0038]
(3)吸去细胞培养板上清，每孔加入100μl病毒滴度为20000copies/ml的感染液，37℃孵育1小时；
[0039]
(4)吸去感染液，每孔使用200μl室温平衡后的pbs清洗3次；
[0040]
(5)吸去pbs后，vero细胞每孔加入200μl 2％ fbs的dmem，人小气道上皮细胞或人角膜缘上皮细胞每孔加入200μl hl培养基继续培养2天；
[0041]
(6)在感染后第2天使用室温平衡后的pbs清洗细胞3次后，使用4％的多聚甲醛固定液浸泡48孔板，在4℃冰箱浸泡至少48h完全灭活新冠病毒后从bsl-3实验室中取出；上清
核酸提取完成后使用2000mg/ml含氯消毒液和75％酒精消毒液喷洒表面后，从bsl-3实验室中取出。
[0042]
(7)吸去48孔板中的多聚甲醛固定液，使用室温平衡后的pbs清洗细胞至少3次，每孔加入0.1ml的细胞通透剂(索莱宝生物)室温透膜20-30min。
[0043]
(8)吸去细胞通透剂后，使用室温平衡后的pbs清洗细胞3次，每孔加入0.1ml 10％(v/v)胎牛血清的pbs缓冲液室温封闭1小时。
[0044]
(9)吸去封闭液后，每孔加入0.1ml含有sars-cov-2nucleocapsid antibody的pbs缓冲液，抗体与pbs比例为1：250(v/v)，4℃孵育12小时。
[0045]
(10)吸去抗体孵育液，每孔使用0.2ml室温平衡后的pbs缓冲液清洗3次后，加入0.1ml体积比为1：1000(v/v)的山羊抗兔lgg h&l pbs缓冲液，室温避光孵育1小时。
[0046]
(11)吸去荧光二抗孵育液，在避光条件下每孔使用0.2ml室温平衡后的pbs缓冲液清洗3次后，每孔补加0.1ml pbs浸没细胞，在荧光显微镜下观察细胞内的病毒np蛋白。
[0047]
(12)使用荧光显微镜在10x物镜下对不同药物梯度孔进行观察，每孔观察至少3个不同视野，具有代表性的免疫荧光图见图3。橙黄决明素能高效地抑制wiv-04感染vero、人小气道上皮细胞和人角膜缘上皮细胞，相比病毒对照孔，100μm与33.3μm的药物处理对病毒感染具有剂量依赖地抗病毒效果。
[0048]
实施例4
[0049]
橙黄决明素对delta、omicron ba1.1、ba2.2、ba5.1株sars-cov-2的抑制效果
[0050]
病毒感染与细胞内病毒np蛋白的检测与实施例3相同，仅将野生型病毒替换为delta、omicron ba1.1、ba2.2、ba5.1等突变株。细胞内np免疫荧光结果如图3所示，感染后第2天，100μm的橙黄决明素能显著抑制sars-cov-2突变株感染vero、人小气道上皮细胞和人角膜缘上皮细胞。
[0051]
综上所述，本发明提供的一种橙黄决明素在covid-19中抗病毒治疗的应用。所述的橙黄决明素在多个细胞模型中对野生型sars-cov-2和突变株具有高效的抑制效果，橙黄决明素在多个细胞系和动物水平上毒副作用低，是国内外尚未报道过的一种新的可用于治疗sars-cov-2感染的小分子活性成分。
[0052]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。