用于高效装载雷帕霉素的多肽纳米材料及制备方法和应用

1.本发明属于纳米材料制备技术领域，具体涉及一种用于高效装载雷帕霉素(rapamycin, rapa)的多肽纳米材料及制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，随着纳米技术应用于临床医学，基于纳米粒子的疗法正在成为治疗动脉粥样硬化的新方法。多肽因其具有良好的生物相容性、低生物毒性、生物可降解性及易于化学修饰等优点，被广泛应用于药物递送等生物医学领域。目前，多肽纳米材料实现药物的装载主要依靠多肽和药物之间的疏水相互作用，通过这种方法装载药物存在着药物装载率低和在输送过程中容易泄露等问题，所以需要设计和开发具有高效装载药物能力的多肽纳米材料，这对治疗动脉粥样硬化等其它疾病是至关重要的。
3.有研究表明，配受体之间的高亲和力可实现配体分子向受体分子的靶向作用，说明配受体之间具有强于普通分子之间疏水作用的特异性相互作用力。如果可以通过配受体相互作用装载药物，这可以提高药物的装载率和输送中的泄露等问题。然而目前的研究集中于通过配受体相互作用实验药物的精准递送，而对于通过配受体相互作用实现高效装载药物的研究相对较少。


技术实现要素：

4.本发明公开了一种用于高效装载雷帕霉素(rapamycin, rapa)的多肽纳米材料及制备和应用，以解决现有技术中上述以及潜在的任一问题。
5.为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于高效装载rapa的多肽纳米材料，该多肽纳米材料具有式ⅰ所示的结构：
6.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式ⅰ，
7.其中，r1为一种具有分子内多重氢键的多肽序列，r2为装载rapa的载药肽，r1与r2之间通过酰胺键连接。
8.进一步，本发明还提供一种上述的多肽纳米材料的自组装方法，该自组装方法为：将所述的多肽纳米材料与有机溶剂和水混合，自组装得到多肽纳米材料溶液。
9.进一步，所述多肽纳米材料具有式ⅱ所示的结构：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式ⅱ，
10.其中，r3为靶向氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxldl)的靶向段；r1与r2之间通过酰胺键连接,r1与r3之间通过酰胺键连接。
11.进一步，所述r1结构为：
12.。
13.进一步，所述r2的装载rapa的载药肽的结构为：
[0014][0015]
或
[0016]
。
[0017]
进一步，所述r3的靶向oxldl的靶向肽的结构为：
[0018]
。
[0019]
优选地，式ⅰ所述用于高效装载rapa的多肽纳米材料为具有以下式 a和式b所示结构：
[0020][0021]
式a；
[0022][0023]
式b。
[0024]
进一步，式ⅱ所述多肽纳米材料为具有以下式c所示结构：
[0025][0026]
式c。
[0027]
一种上述的多肽纳米材料的自组装方法，该自组装方法包括以下步骤：
[0028]
s1）将所述的多肽纳米材料与有机溶剂和水混合，自组装得到多肽纳米材料溶液；
[0029]
s2将s1）得到的多肽纳米材料溶液与oxldl混合，诱导多肽纳米材料自组装形成纳米纤维网状结构。
[0030]
进一步，所述纳米纤维网状结构为β-折叠纳米纤维网状结构；
[0031]
所述oxldl加入至多肽纳米材料溶液中的浓度为1-5μg/ml。
[0032]
进一步，所述有机溶剂与水的体积比为(85-120):1；
[0033]
所述有机溶剂包括二甲基亚砜；
[0034]
所述多肽纳米材料溶液中多肽纳米材料的浓度为(1-5)
×
10-5
m。
[0035]
一种上述的多肽纳米材料在改善动脉粥样硬化中的应用。
[0036]
本发明的有益效果是：由于采用上述技术方案，本发明的多肽纳米材料能够自组装形成纳米颗粒，可实现rapa的包封率和载药率分别达到68.0%和46.8%，且在溶液中的泄露量低至9.3%。此外，对于构建的多功能多肽，rapa的包封率和载药率达到60.2%和41.5%，并且和oxldl的粘附力是和内皮细胞粘附力的3.4倍，说明所构建的多功能多肽可以实现高
效装载rapa和靶向oxldl。
附图说明
[0037]
图1为采用本发明方法的实施例2中rapa和frb结构域/氨基酸序列之间的非共价键个数示意图；
[0038]
图2是实施例2中rapa和frb结构域/氨基酸序列之间的相互作用能示意图；
[0039]
图3是实施例1中多肽和rapa之间的非共价键个数；
[0040]
图4是实施例1中多肽和rapa之间的相互作用能；
[0041]
图5是实施例1中多肽和rapa之间的断裂力；
[0042]
图6是实施例1中多肽和rapa之间的粘附力；
[0043]
图7是实施例1中多肽装载rapa后，rapa的溶剂可及表面积；
[0044]
图8是实施例1中多肽装载rapa的装载率；
[0045]
图9是实施例1中多肽装载rapa后多肽和rapa之间的相互作用能；
[0046]
图10是实施例1中多肽和多肽装载rapa后的透射电镜图；
[0047]
图11是实施例1中多肽和多肽装载rapa后的颗粒粒径图；
[0048]
图12是实施例1中多肽装载rapa的紫外光谱图；
[0049]
图13是实施例1中多肽释药曲线图；
[0050]
图14是实施例5中多功能多肽和rapa之间的氢键个数；
[0051]
图15是实施例5中多功能多肽和rapa之间相互作用能；
[0052]
图16是实施例5中多功能多肽和rapa之间断裂力；
[0053]
图17是实施例5中多功能多肽和rapa之间粘附力；
[0054]
图18是实施例5中多功能多肽装载rapa后，rapa的溶剂可及表面积；
[0055]
图19是实施例5中多功能多肽装载rapa的装载率；
[0056]
图20是实施例5中多功能多肽装载rapa后，多功能多肽和rapa之间的相互作用能；
[0057]
图21是实施例5中多功能多肽和多肽装载rapa后的透射电镜图；
[0058]
图22是实施例5中多功能多肽和多肽装载rapa后的颗粒粒径图；
[0059]
图23是实施例5中多功能多肽装载rapa的紫外光谱图；
[0060]
图24是实施例5中多功能多肽释药曲线图；
[0061]
图25是实施例5中多功能多肽和内皮细胞/oxldl之间粘附力；
[0062]
图26是实施例5中多功能多肽在实施例7中步骤（1）和步骤（2）得到的产物的透射电镜图；
[0063]
图27是实施例5中多功能多肽在实施例7中步骤（1）和步骤（2）得到的产物的圆二色谱图；
[0064]
图28是实施例5中多功能多肽在实施例7中步骤（1）和步骤（2）得到的产物的红外光谱图。
具体实施方式
[0065]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0066]
下述实施例中相应材料和原料无特殊说明，均可从其他商业途径获得。 本发明一种用于结合rapa的多肽纳米材料，该用于高效装载rapa的多肽纳米材料包括十酸、自组装单元和装载rapa的载药肽，具有式ⅰ所示的结构：
[0067]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式ⅰ，
[0068]
其中，r1为自组装单元，为一种具有分子内多重氢键的多肽序列，r2为装载rapa的载药肽，十酸与r1之间通过酰胺键连接，r1与r2之间通过酰胺键连接。
[0069]
十酸的供体为具有以下所示结构:
[0070][0071]
所述r1结构为：
[0072]
。
[0073]
所述r2的装载rapa的载药肽的结构为：
[0074][0075]
或
[0076]
。
[0077]
本发明提供的具备上述结构的多肽纳米材料包括十酸、强氢键作用力的自组装单元、装载rapa的载药肽，所述多肽纳米材料能够自组装形成纳米颗粒，实现高效装载rapa。
[0078]
此外，本发明提供一种用于高效装载rapa和结合oxldl的多功能多肽纳米材料，所述用于高效装载rapa和结合oxldl的多功能多肽纳米材料具有式ⅱ所示的结构：
[0079]
ꢀꢀꢀꢀꢀ
式ⅱ，
[0080]
其中，r1为自组装单元，为一种具有分子内多重氢键的多肽序列，r2为装载rapa的载药肽，r3为靶向oxldl的靶向段，十酸与r1之间通过酰胺键连接，r1与r2之间通过酰胺键连接,r1与r3之间通过酰胺键连接。
[0081]
本发明提供的具备上述结构的多肽纳米材料包括十酸、强氢键作用力的自组装单元、装载rapa的载药肽和靶向oxldl的靶向肽，所述多肽纳米材料能够自组装形成纳米颗粒，实现高效装载rapa，结合动脉粥样硬化斑块中高表达的oxldl，使得巨噬细胞无法识别和吞噬oxldl，并形成纳米纤维同时实现长时间持续释放药物。
[0082]
所述用于高效装载rapa和靶向oxldl的多功能多肽纳米材料中十酸的具有以下所示结构:
[0083][0084]
优选地，所述r1结构为：
[0085]
，
[0086]
即gnnqqny(gly-asn-asn-glu-glu-asn-tyr)；优选地，所述r2结构为：
[0087]
即wdlyyhv(trp-asp-leu-tyr-tyr-his-val);
[0088]
优选地，所述r3结构为：
[0089]
，
[0090]
即ykdg(tyr-lys-asp-gly);
[0091]
本发明提供一种多肽纳米材料的制备方法，所述制备方法为多肽固相合成法。示例性地，所述多肽固相合成法包括以下步骤：
[0092]
1.溶胀树脂；2.脱保护；3.检测；4.偶联；5.检测；6.循环偶联；7.检测；8.偶联bp；9.检测；10.收缩；11.裂解。
[0093]
本发明提供一种根据第一方面所述的多肽纳米材料的自组装方法，所述自组装方法为：将第一方面所述的多肽纳米材料与有机溶剂、水混合，自组装得到多肽纳米材料溶液。
[0094]
所述有机溶剂包括二甲基亚砜。 优选地，所述有机溶剂与水的体积比为(85-120):1，优选为(90-110):1。
[0095]
所述(85-120):1，可以是 85:1、90:1、95:1、100:1、105:1、110:1、115:1 或 120:1 等。
[0096]
所述有机溶剂与水的体积比为(85-120):1，可以保证多肽纳米材料聚集自组装形成纳米颗粒。
[0097]
实施例 1
[0098]
本实施例提供一种多肽纳米材料，其结构如下所示（式a和b）：
[0099][0100]
式a；
[0101][0102]
式b。
[0103]
即在式ⅰ所示的结构中，r1的结构为gnnqqny-k，r2的结构为wdlyyhv（后面以p1表
示）或eeasrly（后面以p2表示）。
[0104]
所述多肽纳米材料以多肽固相合成法制备得到，包括如下步骤：
[0105]
1.溶胀树脂：用n,n-二甲基甲酰胺溶胀fmoc-gly-wangresin树脂4-6h；
[0106]
2.脱保护：用dcm和dmf溶剂交替反复冲洗3遍后，加入7-8ml脱保护剂（dmf:dbu=98:2），摇床上摇15min，完全脱除氨基酸的fmoc基团；
[0107]
3.检测：用dcm和dmf溶剂交替冲洗3遍，在1.5ml离心管中加入kaiser检测试剂以及少量树脂，沸水中加热离心管1min。若树脂颗粒变为紫色，则表明fmoc保护基已被脱除，若紫色很浅或树脂没有变紫，则重复步骤2，直到fmoc完全脱除；
[0108]
4.偶联：称相对树脂载量10倍当量的e氨基酸(fmoc-glu(otbu)-oh）和hbtu于15ml离心管中，加入8-9ml的偶联剂（dmf:n-甲基吗啉=19:1）摇床上预反应10min后加入多肽合成管中，放在摇床上反应1h；
[0109]
5.检测：用dcm和dmf交替冲洗3遍，在1.5ml离心管中加入kaiser检测试剂及少量树脂，在沸水中加热离心管1min。若树脂颜色没有变化，则证明氨基酸偶联成功，如果颜色变为紫色，重复步骤4；
[0110]
6.循环偶联：重复步骤2、3、4、5，完成所有氨基酸的偶联，检测完最后一个氨基酸完全偶联后，用脱保护剂脱去fmoc保护基团；
[0111]
7.检测：重复第二步；
[0112]
8.偶联十酸：十酸-cooh先放在真空干燥箱内避光干燥10h。加入偶联剂，在摇床上预反应10min后倒入多肽合成管中，多肽管上下口加封口膜并用锡箔纸包着放入袋中放在摇床上反应1d；9.检测：重复第五步；
[0113]
10.收缩：在甲醇中收缩树脂15min，将收缩好的树脂转移至10ml血清瓶中；
[0114]
11.裂解：向装有树脂的血清瓶中加入3ml的裂解液(2.5％超纯水 2.5％三异丙基硅烷 95％三氟乙酸)，在冰浴中磁力搅拌3h，抽滤，用tfa润洗血清瓶，再将tfa用氮气吹至剩余少量液体后，加入冰乙醚，再将多肽转移至离心管，4℃，8000r
·
min-1下离心，用冰乙醚重复洗三次后，将多肽转移至1.5ml离心管，用封口膜封口，放在通风橱中过夜使乙醚挥发干净，得到多肽的固体粉末，-20℃保存。
[0115]
实施例2
[0116]
本实施例采用分子动力学模拟方法发现可以和rapa具有较强结合能力的氨基酸序列，首先通过rapa和rapa靶蛋白之间的结合模拟找到rapa靶蛋白和rapa结合的主要氨基酸序列(wdlyyhv和eeasrly)。rapa和我们找到的氨基酸序列之间的成键个数和相互作用能都和frb结构域之间基本相同(图1和图2)，说明我们找到的氨基酸序列是rapa靶蛋白上和rapa结合的主要氨基酸片段。
[0117]
实施例3
[0118]
本实施例采用实施例2中找到的和rapa具有较强相互作用的氨基酸序列作为载药肽，构建了实施例1中p1和p2两种多肽纳米材料作为高效装载rapa的纳米载体。在本实施例中采用md模拟和afm实验研究了p1，p2多肽和rapa之间的相互作用。p1和rapa之间的共价键数最多，其次是p2(图3)。相互作用能结果表明p1和rapa之间的总相互作用能最大，其次是p2(图4)。此外，相互作用力的计算结果显示，rapa和p1,p2之间的断裂力分别为590和422pn
(图5)。基于afm实验的测量结果显示,p1,p2和rapa之间的粘附力分别为3.74357
ꢀ±ꢀ
0.00625 和 2.6071
ꢀ±ꢀ
0.00616 nn(图6)。以上模拟和实验结果都表明p1，p2和rapa之间的都具有较强的相互作用，其中p1和rapa之间的相互作用最强。
[0119]
实施例4
[0120]
本实施例对p1和p2多肽装载rapa的装载率和在水溶液中的泄露率进行了研究。rapa通过共组装方式装载到p1和 p2中。通过md模拟计算 rapa 的包封率和溶液可及表面积 (sasa)以及两种多肽和rapa之间的相互作用能，以评估肽的载药能力。如图7所示，p1和p2中rapa的sasa从1070 nm2左右分别减少到419和502 nm2。p1和p2对rapa的装载率分别为92%和75%(图8)。此外，rapa和两个多肽之间的总相互作用能分别-13728，和-10600 kj/mol(图9)。
[0121]
通过实验方法对多肽装载rapa的能力进行了研究。图10(a)-(b)分别是p1和p2多肽纳米颗粒的tem照片，可以看出两种多肽都形成了直径为20nm左右的球型纳米颗粒。图10(c)-(d)分别是p1和p2载药纳米颗粒的tem照片，载药纳米颗粒的直径分别为40和29nm，结果表明装载rapa之后多肽纳米颗粒的直径变大。多肽和载药纳米颗粒的dls粒径测量实验结果也验证了这一结论，且p1载药纳米颗粒的直径大于p2(图11)。载药纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱在 277 nm 处显示出特征峰，我们根据标准曲线测定rapa浓度，结果表明p1和p2多肽纳米颗粒对rapa的包封率分别为68.0%和48.6%，载药率分别为46.8%和36.5%(图12)。此外，我们通过平衡透析绘制药物释放曲线，以研究rapa在水溶液中的泄露情况。在药物释放曲线中(图13)，p1和p2纳米颗粒在192h时都保持了90.7%和87.3%的rapa储存，这允许更多的药物被输运到斑块中。
[0122]
本实施例结果表明p1和p2具有较强的rapa载药能力和较低的药物泄露量，说明p1和p2可以作为高效装载rapa的药物载体，其中p1装载rapa的能力最强。
[0123]
实施例5
[0124]
本实施例提供了一种可以高效装载rapa和靶向oxldl的多功能多肽(p3)纳米颗粒，其结构如下所示（式c）：
[0125][0126]
即在式ⅱ所示的结构中，r1的结构为gnnqqny-k，r2的结构为wdlyyhv，r3的结构为ykdg。
[0127]
所述多肽纳米材料的多肽固相合成法参考实施例 1。
[0128]
通过md模拟计算表明p3和rapa之间的氢键成键数量多(图14)和相互作用强(图
15)。此外，采用md模拟计算得到的p3和rapa之间的断裂力(图16)以及afm实验测量得到的粘附力都说明p3和rapa之间具有强相互作用(图17)。
[0129]
此外，rapa通过共组装方式装载到p3中。通过md模拟计算 rapa 的包封率和溶液可及表面积(sasa)以及两种多肽和rapa之间的相互作用能，以评估肽的载药能力。如图18所示，p3中rapa的sasa从1070 nm2减少到450 nm2。p3对rapa的装载率为85%(图19)。此外，rapa和p3之间的总相互作用能为11628kj/mol(图20)。
[0130]
通过实验方法对多肽装载rapa的能力进行了研究。图21(a)-(b)分别是p3多肽纳米颗粒和p3载药纳米颗粒的tem照片，结果表明装载rapa之后多肽纳米颗粒的直径由20nm增长至38nm。多肽和载药纳米颗粒的dls粒径测量实验结果也验证了这一结论(图22)。载药纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱在 277 nm 处显示出特征峰，我们根据标准曲线测定rapa浓度，结果表明p3多肽纳米颗粒对rapa的包封率和载药率分别为60.2%和41.5%（图23)。此外，我们通过平衡透析绘制药物释放曲线，以研究rapa在水溶液中的泄露情况。在药物释放曲线中(图24)，p3纳米颗粒在192h时保持了89.1%的rapa储存，这允许更多的药物被输运到斑块中。本实施例结果表明多功能多肽p3可实现高效装载rapa。
[0131]
实施例6
[0132]
本实施例采用afm实验测量了p3分别和内皮细胞/oxldl之间的粘附力，结果表明，p3和oxldl之间的粘附力是和内皮细胞之间粘附力的3.4倍(图25)。本实施例说明多功能多肽p3和oxldl之间具有特异性配受体相互作用，p3可作为靶向动脉粥样硬化斑块中oxldl的纳米材料。
[0133]
实施例7
[0134]
本实施例对实施例5中的多肽纳米材料进行自组装，方法如下：
[0135]
（1）将实施例5中的多肽纳米材料溶于二甲基亚砜（水中，使得多肽纳米材料的浓度为3
×
10-3
m，取10μl上述溶液置于离心管中，将990μl超纯水缓慢加入离心管中，所得混合溶液中多肽纳米材料的浓度为3.0
×
10-5
m；
[0136]
（2）向步骤（1）得到的混合溶液中加入oxldl，使得oxldl的浓度为2μg/ml，两天后即可得到多肽纳米纤维分散液。
[0137]
采用透射电镜针对步骤（1）得到的多肽纳米材料的混合溶液以及步骤（2）得到的多肽纳米纤维分散液进行表征，结果表明在与oxldl作用后，多肽纳米材料从直径为33.9
±
2.3nm的球形纳米颗粒转化直径为21.0
±
3.1nm的纳米纤维网络(图26)。
[0138]
针对步骤（1）得到的多肽纳米材料的混合溶液以及步骤（2）得到的多肽纳米纤维分散液进行圆二色谱的表征，结果如图27所示，p3与oxldl孵育后的特征cd信号在195nm处显示正信号，在216nm处显示负信号，这表明p3可以在oxldl诱导下通过氢键相互作用自组装成富含 β-折叠的纳米纤维。
[0139]
针对步骤（1）得到的多肽纳米材料的混合溶液以及步骤（2）得到的多肽纳米纤维分散液进行红外光谱的表征，结果如图28所示，多肽骨架酰胺键伸缩振动峰从0h的1647cm-1
转变为1629cm-1
，证实形成了β-折叠结构。